교신저자：배창훈, 705-717 대구광역시 남구 대명5동 317-1  영남대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
교신저자：전화：(053) 620-3784 · 전송：(053) 628-7884 · E-mail：baich@med.yu.ac.kr

서     론

   인체의 기도는 점액으로 덮여 있고 기도에서 생성되는 점액의 양은 그 생산율과 제거율에 의하여 균형을 이루게 된다.¹⁾ 정상 상태에서 점액은 방어기능을 하지만 천식, 만성기관지염, 비부비동염 등과 같은 염증성 호흡기 질환에서는 점액의 분비가 과다해져서 증상이 유발된다.²⁾ 특히 비용을 동반한 만성 비부비동염의 경우 점액의 과생성은 대개 비용에 의해 이차적으로 생긴 비부비동염의 결과로 생각되나 비용의 상피에 존재하는 분비세포에서 점액 분비가 증가하는 것도 부분적인 원인이다.³⁾
   점액 분비를 조절하는 점액유전자는 인체의 기도에서 MUC1, 2, 3, 4, 5AC, 5B, 7, 8 점액유전자가 발현된다.^4,5) 특히 비강 및 상악동 점막에서는 MUC1, 2, 4, 5AC, 5B, 7, 8 점액유전자가 주로 발현되고, 비용상피세포에서는 MUC4, 5AC 점액유전자가 다른 점액유전자보다 높게 발현된다.^6,7)
   최근 들어 macrolide 항생제가 만성 비부비동염, 확장성 범세기관지염, 기관지 천식과 같은 만성 호흡기 염증 질환에서 치료제로 자주 이용되고 있고,^8,9) 그 작용의 정확한 기전은 아직 명확하지 않지만 일반적으로 macrolide는 임상적으로 항생제 효과와 항분비 및 스테로이드 절약 효과가 있다고 알려져 있으며 특히 항분비 효과는 macrolide를 장기 투여 시 점액 분비를 유의 있게 감소시키고 점액의 탄력성을 증가시키며 유동성도 변화시킨다.^10,11)
   그러나 아직까지 비용상피세포에서 macrolide가 MUC4 점액유전자 발현과 단백 분비에 미치는 효과에 관한 보고는 거의 없는 실정이다. 이에 본 연구에서는 배양된 인체 비용상피세포와 인체 호흡기 NCI-H292 상피세포에서 interleukin-1β(IL-1β)에 의해 유도된 MUC4 점액유전자 발현과 단백 분비에 대한 roxithromycin의 효과에 대해 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

세포배양 및 처치
   천식과 알레르기성 비염이 동반하지 않으며 최근 4주 동안 급성 악화나 약물 투여를 하지 않은 비용을 동반한 만성 비부비동염 환자 20명에서 내시경 비부비동 수술 시 비용조직과 사람 호흡기 상피세포인 폐의 점액상피양 암종 세포주(Human lung mucoepidermoid carcinoma cell line)인 NCI-H292(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)를 세포배양에 사용하였다.
   수술시 채취한 비용조직을 4℃에서 30분간 1% phosphate buffered saline(PBS)에 넣어 두었다가 꺼내어 PBS로 2번 세척 후 60 mm tissue culture dish에 놓고 혈액이나 섬유아세포를 없애기 위해 결체조직을 제거하였다. 결체조직이 제거된 비용상피가 위로 오도록 하여 60 mm tissue culture dish에 넣은 후 상피가 다 잠길 정도로 dispase 10 ml 정도 첨가한 후 95%의 산소와 5%의 이산화탄소가 가습된 배양기에서 37℃의 온도로 1시간 30분 동안 배양하였다. 이후 15번 수술용 칼로 비용의 상피 표면을 깨끗하게 긁어내어 1% PBS를 25 ml 첨가한 후 200 mesh에다 걸러내고 falcon tube(15 ml)에 담아 3,000 rpm에서 5분간 원심 분리하였다. PBS를 제거하고 6 ml의 EpiLife Medium(Cascade Biologics, Portland, OR, USA) 배지와 Human Keratinocyte Growth Supplement(HKGS, Cascade Biologics, 5 ml/500 ml of medium)를 첨가하고 24-well plate에 1 ml씩 접종하였다. 현미경으로 세포의 양을 확인한 후 2일마다 HKGS를 첨가한 EpiLife Medium 배지를 교체하면서 실험에 사용하였다.
   NCI-H292 상피세포는 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin과 10% fetal calf serum을 첨가한 RPMI 1640(GibcoBRL, Grand Island, NY, USA) 배지를 이용하여 95%의 산소와 5%의 이산화탄소가 가습된 대기에서 37℃의 온도로 배양하였고, 2주마다 이차배양을 하였다. 세포들은 6-well plate에 1×10⁶ cells/well의 농도로 접종하였다. 배양이 어느 정도 이루어지면 세포를 24시간 동안 0.5% fetal calf serum을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 배양하였고 serum-free RPMI 1640 배지로 세척한 후 실험에 사용하였다.
   배양된 NCI-H292 상피세포와 인체 비용상피세포에 각각 10 ng/ml와 20 ng/ml의 IL-1β(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 처치하여 MUC4 점액유전자 발현을 유도시켰다. Macrolide의 효과를 알아보기 위하여 배양된 NCI-H292 상피세포와 인체 비용상피세포에 50 μM, 100 μM, 200 μM 농도의 roxithromycin(HANDOK Pharmaceuticals Co., LTD., Seoul, Korea)을 1시간 전에 전처치한 후 각각 10 ng/ml와 20 ng/ml 농도의 IL-1β를 처치하였다. 대조군에서는 동일한 시간동안 배지에만 배양하였다.

Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR)을 이용한 MUC4 점액유전자의 측정
   배양된 세포를 2% bovine serum albumin을 함유한 PBS로 3회 세척한 후 총 mRNA를 Tri-Reagent(Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA)를 이용하여 추출하였고, MUC4 mRNA의 측정은 변형된 RT-PCR 방법을¹²⁾ 이용하였다. 전체 mRNA를 무작위 hexanucleotide primer들과 Moloney murine leukemia virus(MMLV) reverse transcriptase(Perkin Elmer, Morrisville, NC, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사하였다. 중합효소연쇄반응의 oligonucleotide primer는 공인된 인간 MUC4 염기서열(sense：TTC TAA GAA CCA CCA GAC TCA GAG C；antisense：GAG ACA CAC CTG GAG AGA ATG AGC)을 기준으로 설계하였다. 각 반응의 내부 양성 대조군(internal positive control)은 β₂-microglobulin(β₂M)으로 oligonucleotide primer(sense：TCG CGC TAC TCT CTC TTT CTG G；antisense：GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC TTA A)는 Clontech Laboratories(Palo Alto, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 각 cDNA 크기는 MUC4는 467 bp이고 β₂M은 360 bp였다. MUC4의 중합효소연쇄반응은 2.5 mg MgCl₂를 첨가하여 95℃에서 60초간 변성(denaturation)과정과 61℃에서 30초간 결합(annealing)반응 및 72℃에서 60초간 연장(extension)반응을 30회 반복한 후 72℃에서 20분간 최종 연장반응을 시행하였다. 증폭된 중합효소연쇄반응의 산물은 ethidium bromide가 함유된 1% agarose gel을 통한 전기영동을 이용하여 분리 관찰하였다. 또한 이를 나열(sequencing)하여 염기서열을 확인하였다. 확인된 띠(band)의 세기는 반정량적으로 분석하기 위하여 densitometry를 이용하였고 relative density는 대조군의 density를 1로 하였을 때 실험군의 density 값을 비율로 나타내 비교하였다.

면역분석법(immunoassay)을 이용한 MUC4 단백의 측정
   MUC4 단백의 함량을 측정하기 위해서 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법을 이용하였다. 시료를 처리한 배양된 세포에서 lysis buffer(50 mM Tris·Cl , 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid, 1% Triton X-100, and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride)로 단백을 추출하여 정량하였다. 추출한 단백 100 μg을 96-well plate에서 40℃에서 건조될 때까지 배양한 후 plate를 PBS로 3회 세척하였다. 2% bovine serum albumin으로 실온에서 1시간 동안 차광한 후 PBS로 3회 세척한 다음 0.05% MUC4 항체(Zymed, San Francisco, CA, 1：1000)가 함유된 Tween 20로 배양하였다. 다시 PBS로 3회 세척한 후 이차항체인 horeseradish peroxidase-goat anti-rabbit IgG conjugate(Santa cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, 1：10,000)를 각 well에 첨가하였고 4시간 후에 각 well을 PBS로 3회 세척하였다. 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine peroxidase 용액으로 발색한 후, 2N-H₂SO₄를 이용하여 중단시켰다. 흡광도는 450 nm에서 단백의 양을 측정하였다.

통계 처리
   통계 처리는 SPSS(for windows, release ver 12.0)를 사용하여 95%의 유의 수준에서 student's t-test를 이용하였다.

결     과

배양된 NCI-H292 세포에서 IL-1β에 의해 유도된 MUC4 mRNA와 단백 분비에 대한 roxithromycin의 효과
   NCI-H292 세포에서 IL-1β(10 ng/ml)을 첨가하였을 경우 MUC4 mRNA의 발현과 단백 분비가 증가하였고, 50 μM, 100 μM, 200 μM 농도의 roxithromycin의 투여는 IL-1β로 유도된 MUC4 mRNA 발현 수준과 단백 분비를 대조군에 비해 용량 의존적으로 의미 있게 감소시켰다(p<0.05, Fig. 1, Table 1). 한편 roxithromycin(50 μM)만 투여하고 IL-1β를 처리하지 않은 경우에서는 어떠한 처리를 하지 않은 대조세포군과 비슷한 정도의 MUC4 mRNA 발현 수준과 단백 분비를 보였다(Fig. 1, Table 1).

배양된 인체 비용상피세포에서 IL-1β에 의해 유도된 MUC4 mRNA와 단백 분비에 대한 roxithromycin의 효과
   인체 비용상피세포에서 IL-1β(20 ng/ml)을 첨가하였을 경우 MUC4 mRNA의 발현과 단백 분비가 증가하였고, 50 μM, 100 μM, 200 μM 농도의 roxithromycin의 투여는 IL-1β로 유도된 MUC4 mRNA 발현 수준과 단백 분비가 대조군에 비해 용량 의존적으로 의미 있게 감소시켰다(p<0.05, Fig. 2, Table 2). 한편 roxithromycin(50 μM)만 투여하고 IL-1β를 처리하지 않은 경우에서는 어떠한 처리를 하지 않은 대조세포군과 비슷한 정도의 MUC4 mRNA 발현 수준과 단백 분비를 보였다(Fig. 2, Table 2).

고     찰

   호흡기도 상피의 표면은 배세포(goblet cell)와 점막하 분비선(submucosal gland)에서 분비된 점액으로 덮여 있다. 점액은 호흡기도 상피와 외부와의 방어벽을 형성하여 흡입된 입자나 미생물을 포획하여 제거하는 역할을 담당한다. 호흡기도 점액은 95%가 물과 무기질로 구성되며 나머지 5%는 점액단백, lysozyme, lactoferrin, defensins, kallikrein, antiprotease, secretory component, serum transudate proteins, IgA, IgG, proteoglycan, lipid 등을 포함하고 있다.³⁾
   점액의 분비를 조절하는 인간 점액유전자는 현재까지 18개 정도 알려져 있고 이들 중 인체의 기도 중 비강 및 상악동 점막에서는 MUC1, 2, 4, 5AC, 5B, 7, 8 점액유전자가 주로 발현된다.^4,5) 이 중에서 MUC4 점액유전자는 3q29에 위치하며, 막결합 형태로 기도 상피세포, 대장, 위, 자궁경부, 폐에 주로 존재하며 단백질 분해나 transmembrane domain의 alternative splicing에 의해 분비형으로 세포로부터 방출되기도 한다.¹³⁾
   점액을 과다 분비하는 비용상피세포에서 Ali 등⁶⁾이 in situ hybridization 방법으로 MUC5AC와 더불어 MUC4 점액유전자의 발현을 보고하였으며, Martinez-Anton 등⁷⁾도 면역화학적 방법으로 MUC1, 2, 5AC, 5B, 8 점액유전자와 함께 MUC4 점액유전자 발현을 보고하였다. 또한 만성 비부비동염을 동반한 비용 점막에서 점액의 분비가 증가하고, 염증 매개물질인 IL-1β에 의해서 MUC8 mRNA의 발현이 증가하고 MUC5AC mRNA의 발현은 감소된다는 보고도 있다.¹⁴⁾ 본 연구에서도 배양된 NCI-H292 상피세포와 인체 비용상피세포에서 IL-1β에 의해서 MUC4 점액유전자 발현과 단백 분비가 증가됨을 알 수 있었다.
   Macrolide는 macrocyclic lactone ring에 한 개 또는 그 이상의 탈산소당(deoxy-sugar)이 결합되어 있는 항생물질로 그 구조에 따라 12, 14, 15, 16-membered lactone ring으로 크게 4가지로 나누며 개발된 연도에 따라 1세대 macrolide(erythromycin, josamycin, midecamycin, oleandomycin, spiramycin)와 2세대 macrolide(azithromycin, clarithromycin, roxithromycin)로 분류한다. 2세대 macrolide는 1세대 macrolide보다 위산에 의해 쉽게 파괴되지 않아 위장관에서 흡수가 잘 되며, 반감기가 길고, cytochrome P450과 같은 효소를 억제하지 않기 때문에 간독성이 적으며, 약물 간의 상호작용 또한 적다.^9,10) 한편 2세대 macrolide 중 14-membered lactone ring macrolide(clarithromycin, roxithromycin)는 1세대 macrolide에 비해 상기와 같은 장점과 고유한 항생제작용인 항균작용이나 정균작용 이외에 비교적 강력한 항염증작용이 있어 항염증 목적으로도 널리 사용되고 있다. 특히 항염증 목적으로 2세대 macrolide가 기도질환에 사용될 경우에는 정상 용량보다 적은 양을 장기간 사용했을 때에도 효과적인 항염증 작용이 있어, 이로 인한 기도 점막의 항분비 효과도 같이 일어난다.^{10,15,16,17,18)}
   Macrolide의 항분비 효과 중 점액유전자와 점액 분비에 대해서는 NCI-H292 상피세포에서 Kim 등⁵⁾은 roxithromycin이 IL-1β에 의해 유도된 MUC2/5AC 유전자 발현과 점액 분비를 억제한다고 보고하였고, Imamura 등¹⁹⁾도 azithromycin이 extracellular signal-regulated kinase(ERK) 신호전달체계에 관여하여 MUC5AC 점액유전자 발현을 억제한다고 보고하였다. 또한 Kim 등²⁰⁾은 roxithromycin이 장관상피세포(intestinal epithelial cell)에서도 nuclear factor kappa B의 활성화를 방해하여 MUC2 점액유전자 발현을 억제한다고 보고하였다. 본 연구에서는 macrolide인 roxithromycin이 배양된 인체 호흡기 NCI-H292 상피세포와 인체 비용상피세포에서 IL-1β에 의해 유도된 MUC4 점액유전자 발현과 단백 분비를 억제하였다. 따라서 비강 및 부비동 점액의 분비를 줄일 목적으로 기존에 많이 사용되던 스테로이드 이외에 macrolide는 염증성 비강 및 부비동 질환에서 비루와 같은 점액의 분비를 감소시킬 목적으로 널리 이용될 수 있을 것으로 생각되며 이에 관한 정확한 기전을 밝히기 위해 신호전달체계에 대한 연구 등의 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

결     론

   배양된 인체 호흡기 NCI-H292 상피세포와 인체 비용상피세포에서 roxithromycin은 MUC4 점액유전자의 발현을 억제하여 점액 분비를 억제하는 것으로 생각된다.

1. Kim YD, Chang KY, Sin JH, Kwak DS, Lee HJ, Song SY, et al. Vasoactive intestinal peptide induces MUC2/5AC synthesis in human airway epithelial cells. Korean J Otolaryngol-Head Neck Surg 2004;47(7):639-44.

2. Kim YD, Cho JS, Chang KY, Sin JH, Song SY, Yoon SK. Budesonide down-regulates IL-1β-mediated MUC2/MUC5AC genes expression and mucin secretion in human airway epithelial cells. Korean J Otolaryngol-Head Neck Surg 2002;45(9):873-7.

3. Kim SS, Kim KS, Lee JG, Park IY, Koo JS, Yoon JH. Levels of intracellular protein and messenger RNA of mucin and lysozyme in normal human nasal and polyp epithelium. Laryngoscope 2000;110(2 pt 1):276-80.

4. Yoon JH, Kim KS, Kim SS, Kim JW, Lee JG, Park IY. Comparison of mucin and lysozyme expression between human in vivo nasal epithelial cells and cultured nasal epithelial cells. Korean J Otolaryngol-Head Neck Surg 1999;42(3):317-21.

5. Kim YD, Cho JS, Kim HS, Song SY. Effect of macrolides on the interleukin-1β-mediated MUC2/5AC genes expression and mucin secretion in human airway epithelial cells. J Rhinol 2002;9(2):52-6.

6. Ali MS, Wilson JA, Bennett M, Pearson JP. Mucin gene expression in nasal polyps. Acta Otolaryngol 2005;125(6):618-24.

7. Martinez-Anton A, Debolos C, Garrido M, Roca-Ferrer J, Barranco C, Alobid I, et al. Mucin genes have different expression patterns in healthy and diseased upper airway mucosa. Clin Exp Allergy 2006;36(4):448-57.

8. Suzuki H, Ikeda K, Honma R, Gotoh S, Oshima T, Furukawa M, et al. Prognostic factors of chronic rhinosinusitis under long-term low-dose macrolide therapy. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec 2000;62(3):121-7.

9. Gotfried MH. Macrolides for the treatment of chronic sinusitis, asthma, and COPD. Chest 2004;125(2 suppl):52-60.

10. Zhanel GG, Dueck M, Hoban DJ, Vercaigne LM, Embil JM, Gin AS, et al. Review of macrolides and ketolides: Focus on respiratory tract infections. Drugs 2001;61(4):443-98.

11. Shimizu T, Shimizu S, Hattori R, Gabazza EC, Majima Y. In vivo and in vitro effects of macrolide antibiotics on mucus secretion in airway epithelial cells. Am J Respir Crit Care Med 2003;168(5):581-7.

12. Kim YD, Kwon EJ, Kwon TK, Baek SH, Song SY, Suh JS. Regulation of IL-1beta-mediated MUC2 gene in NCI-H292 human airway epithelial cells. Biochem Biophys Res Commun 2000;274(1):112-6. 

13. Audie JP, Tetaert D, Pigny P, Buisine MP, Janin A, Aubert JP, et al. Mucin gene expression in the human endocervix. Hum Reprod 1995;10(1):98-102.

14. Seong JK, Koo JS, Lee WJ, Kim HN, Park JY, Song KS, et al. Upregulation of MUC8 and downregulation of MUC5AC by inflammatory mediators in human nasal polyps and cultured nasal epithelium. Acta Otolaryngol 2002;122(4):401-7.

15. Oda H, Kadota J, Kohno S, Hara K. Leukotriene B4 in bronchoalveolar lavage fluid of patients with diffuse panbronchiolitis. Chest 1995;108(1):116-22.

16. Enomoto F, Andou I, Nagaoka I, Ichikawa G. Effect of new macrolides on the expression of adhesion molicules on neutrophils in chronic sinusitis. Auris Nasus Larynx 2002;29(3):267-9.

17. Iino Y, Toriyama M, Kudo K, Natori Y, Yuo A. Erythromycin inhibition of lipopolysaccharide-stimulated tumor necrosis factor alpha production by human monocytes in vitro. Ann Otol Rhinol Laryngol Suppl 1992;157:16-20.

18. Suzuki H, Asada Y, Ikeda K, Oshima T, Takasaka T. Inhibitory effect of erythromycin on interleukin-8 secretion from exudative cells in the nasal discharge of patients with chronic sinusitis. Laryngoscope 1999;109(3):407-10.

19. Imamura Y, Yanagihara K, Mizuta Y, Seki M, Ohno H, Higashiyama Y, et al. Azithromycin inhibits MUC5AC production induced by the Pseudomonas aeruginosa autoinducer N-(3-Oxododecanoyl) homoserine lactone in NCI-H292 cells. Antimicrob Agents Chemother 2004;48(9):3457-61.

20. Kim DY, Takeuchi K, Ishinaga H, Kishioka C, Suzuki S, Basbaum C, et al. Roxithromycin suppresses mucin gene expression in epithelial cells. Pharmacology 2004;72(1):6-11.