서 론
점액의 과분비는 염증성 호흡기 질환 악화의 중요한 병인 중 하나로 이를 해결하기 위해 많은 연구들이 활발히 이루어 지고 있다. 그러나 아직까지 점액 과분비에 대한 명확한 기전에 대한 이해와 효과적인 치료제의 개발이 부족한 실정이다. 점액의 성상은 점액 유전자에 발현 양상과 깊이 관여되어 있으며, 염증성 호흡기 질환에서 다양한 양상의 점액 유전자의 과발현이 관찰되는 것으로 알려져 있다[1,2]. 점액 유전자는 현재까지 20여 개가 발견되었고, 이 중 막결합형 점소인 MUC4와 분비형 점소인 MUC5AC는 다양한 염증성 호흡기 질환에 깊게 연관되어 있는 대표적인 점액 유전자로 알려져 있다[3,4].
호흡기 상피 세포 간의 결합은 기도를 보호하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 세포 간의 결합에는 밀착연접(tight junction), 접착연접(adherens junction), 데스모솜(desmosome), 헤미데스모솜(hemidesmosome), 간극연접(gap junction) 등이 관여하는 것으로 알려져 있고, 다양한 염증성 매개물질과 독성물질 등에 의해 세포연접(cell junction)이 약화되거나 손상되면 상피-중간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition, EMT)가 발생하게 된다[5,6]. 이는 최근 천식이나 만성폐쇄성 폐질환과 같은 염증성 호흡기 질환 악화의 중요한 병인 중 하나로 밝혀지고 있다[7-9].
염증성 호흡기 질환의 치료제 중 가장 널리 사용되는 스테로이드는 점액의 과분비 및 상피-중간엽 전이를 억제하는 효과가 보고된 강력한 항염증 약물이다[10]. 그러나 다양한 부작용으로 인해 사용이 제한되고 장기간 사용이 어려워 여전히 한계점으로 남아있어 스테로이드를 대체할 치료제에 대한 필요성이 대두되고 있다. 인삼 사포닌(ginsenoside)의 활성화 산물 중 하나인 Rb1은 항염증과 항당뇨, 항암, 항산화 등을 포함한 다양한 생물학적 작용을 가지고 있어 다양한 질환에서 치료효과가 보고되고 있다[11-15]. 하지만 아직까지 호흡기 점액 유전자 발현과 상피-중간엽 전이에 미치는 효과에 대해서는 알려진 것이 거의 없다[15]. 저자들은 NCI-H292 세포에서 Rb1이 TGF-β1에 의해 유도된 MUC4/5AC 과생성과 상피중간엽 전이에 대한 억제효과를 스테로이드와의 비교를 통해 확인해보고자 하였으며, 이를 통해 염증성 호흡기 질환의 치료제로서의 ginsenoside Rb1의 가능성을 알아보고자 하였다.
재료 및 방법
세포 배양 및 처치
NCI-H292 세포(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin, 10% fetal bovine serum이 포함된 RPMI 1640 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 5%의 이산화탄소 조건 하에서 37°C의 온도로 배양하였다. 6-well plate에 1×106 cells/well의 밀도로 세포를 도포하여 배양하였다.
Rb1이 TGF-β1에 의해 유도된 점액 유전자 발현과 세포연접 단백의 발현 변화에 미치는 영향을 알아보기 위해서 NCI-H292 세포에 각기 다른 농도의 Rb1(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 전처치한 후 1시간 뒤에 5 ng/mL 농도의 TGF-β1(R&D systems, Minnesota, MN, USA)를 투여하였다. 또한 Rb1과 dexamethasone(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)의 점액 유전자 발현 및 세포연접 단백 생성에 미치는 영향을 비교 관찰하기 위하여 NCI-H292 세포에 각기 다른 농도의 dexamethasone을 전처치한 후 1시간 뒤에 5 ng/mL 농도의 TGF-β1을 투여하였다. 처리 약제에 대한 NCI-H292 세포의 세포독성 유무는 WST-1 분석(EZ-CYTOX; Daeil Lab., Seoul, Korea)과 현미경을 이용한 세포 형태 변화 유무를 확인하여 검증하였다. 본 연구에서 시행된 모든 실험은 3개의 독립된 세포배지에서 3회 이상 반복된 실험을 통해 얻은 결과로 분석하였으며, 본원 임상 시험 심사 위원회(Institutional Review Board)의 승인을 받아 시행하였다(YUMC 2017-07-015).
Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 분석
RNA에 대한 분석은 Gene Amp RNA PCR core kit와 MyCycler PCR(Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 기계를 사용하였다. PCR에 사용된 기존연구에서 사용된 primer를 토 대로 제작하여 사용하였다(Table 1). RT-PCR 검사는 세포에 0, 5, 10 μM 농도의 Rb1 또는 0, 10 nM 농도의 dexamethasone을 전처치한 후 1시간 뒤에 5 ng/mL 농도의 TGF-β1을 투여하고, 8시간 후에 배양된 세포를 phosphate buffered saline로 3회 세척한 후 mRNA를 추출하여 측정하였다.
Real-time PCR 분석
합성된 cDNA 0.5 μL를 대상으로 iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)를 사용하여 real-time PCR을 수행하였다. Real-time PCR은 최종량이 10 μL가 되게, 2.5 mM의 MgCl2와 그 최종 농도가 0.5 μM이 되게 primer를 투여하였으며, 25 ng의 RNA 1 μL를 이용하여 실험을 수행하였다. 정량적인 PCR은 Light-Cycler(Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다.
Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) 면역 분석법
고분자인 MUC4와 MUC5AC 단백 생성을 측정하기 위해서 ELISA법을 이용하였다. ELISA 검사는 세포에 0, 5, 10 μM 농도의 Rb1 또는 0, 10 nM 농도의 dexamethasone을 전처치한 후 1시간 뒤에 5 ng/mL 농도의 TGF-β1을 투여하고, 24 시간 후에 배양된 세포에서 radioimmunoprecipitation assay buffer로 단백을 추출하였으며, ELISA reader(EL800Ⓡ, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 표준곡선을 이용하여 단백의 양을 정량하였다.
Western blot 분석
밀착연접단백인 occludin, claudin 4와 claudin 18과 접착연접단백인 E-cadherin과 N-cadherin 단백의 생성을 측정하기 위해서 western blot법을 이용하였다. Western blot 검사는 세포에 0, 5, 10 μM 농도의 Rb1 또는 0, 10 nM 농도의 dexamethasone을 전처치한 후 1시간 뒤에 5 ng/mL 농도의 TGF-β1을 투여하여 배양하였다. 항체와의 비특이적 결합을 억제 시킨 후 세포연접단백들을 일차 항체로 각각 4시간 반응시켰다. 이후 Tris-buffered saline와 Tween-20 buffer로 세척하고 이차 항체로 각각 1시간 반응한 다음 세척하여 enhanced chemiluminescence reagent kit를 이용하여 각각의 단백의 띠(band)를 확인하였다. 확인된 띠의 세기는 Scion Image software(Scion Corporation, Frederick, MD, USA)를 이용하여 반정량적으로 분석하여 상대적인 density로 나타내었다.
결 과
Rb1 또는 Rb1과 TGF-β1 복합 처치 시 NCI-H292 세포에 미치는 영향
WST법을 이용한 세포독성검사에서 20 μM 농도의 Rb1 및 5 ng/mL 농도의 TGF-β1투여까지는 세포 독성이 관찰되지 않았다(Fig. 1).
Rb1이 TGF-β1로 유도된 MUC4/5AC 발현에 미치는 영향
NCI-H292 세포에서 TGF-β1에 의해 유도되는 MUC4와 MUC5AC의 mRNA 발현 및 점액 단백 생성은 Rb1을 전처치한 군에서 통계학적으로 의미있게 감소하였다. 또한 mRNA 발현 및 점액 단백 생성량 모두 고용량(10 μM)을 투여한 군에서 저용량(5 μM)을 투여한 군보다 감소하는 경향을 보였다(Fig. 2).
Rb1이 TGF-β1로 유도된 밀착연접단백의 발현변화에 미치는 영향
TGF-β1이 occludin, claudin 4과 claudin 18의 발현에 미치는 영향 및 Rb1이 TGF-β1에 의해 유도된 밀착연접 단백의 발현변화에 미치는 영향을 확인해본 결과, TGF-β1는 occludin과 claudin 18의 mRNA 발현 및 단백 생성을 감소시켰으나, Rb1또는 dexamethasone을 전처치한 군에서는 TGF-β1에 의한 occludin과 claudin 18의 발현 감소가 나타나지 않았다(Fig. 3A-C). 또한 claudin 4는 TGF-β1의해 mRNA 발현과 단백 생성이 증가하였으나, Rb1 또는 dexamethasone을 전처치한 군에서 TGF-β1에 의한 claudin 4의 발현 증가가 의미있게 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 3D-F).
Rb1이 TGF-β1로 유도된 접착연접단백의 발현변화에 미치는 영향
TGF-β1가 E-cadherin과 N-cadherin의 발현에 미치는 영향 및 Rb1이 TGF-β1에 의해 유도된 접촉연접 단백의 발현변화에 미치는 영향을 확인해본 결과, TGF-β1는 E-cadherin의 발현을 감소시켰으며, Rb1 또는 dexamethasone을 전처치한 군에서는 TGF-β1에 E-cadherin의 발현 감소가 나타나지 않았다(Fig. 4A-C). 또한 TGF-β1에 의해 N-cadherin 발현이 증가하였으며, Rb1 또는 dexamethasone을 전처치한 군에서 TGF-β1에 의한 N-cadherin의 과발현이 의미있게 억제됨을 확인할 수 있었다(Fig. 4D-F).
고 찰
인삼의 약리학적 효과를 나타내는 인삼 사포닌(ginseng saponin, ginsenoside)은 활성 산물 중 가장 중요한 성분이다. 그 구조에 따라 protopanaxadiol, protopanaxatriol, oleanole acid로 나눌 수 있으며, 그 종류는 100개 이상으로 알려져 있다. 그 중 protopanaxadiol은 총 19개의 종류가 존재하며, Rb1, Rb2, Rc, Rd가 대표적으로 알려져 있다[14,15]. 최근 다양한 연구에서 염증성 호흡기 질환에 대한 인삼 사포닌의 치료효과가 보고되고 있다[16-18]. Jung 등[16]의 연구에서는 알레르기성 비염환자에서 홍삼이 코막힘을 포함한 비염환자의 삶의 질 척도가 호전된다고 보고하였으며, Lee 등[17]의 연구에서는 A549세포와 천식환자의 폐조직에서 인삼의 사포닌 성분 중 하나인 Rg3이 interleukin(IL)-4, TNF-α, eotaxin 등을 의미있게 감소시키며, IL-1β에 의해 유도된 COX-2의 활성화를 억제한다는 것을 보고하였다. 또한 Shergis 등[18]의 연구에는 Rb1이 만성폐쇄성 폐질환의 염증성 반응 과정의 주된 신호 전달체계로 알려진 TNF, IL-6, IL-8 등의 사이토카인의 활성화 과정을 억제하며, 산화적 스트레스를 일으키는 주된 요소인 활성산소, 산화질소 등의 발생과정을 억제하는 것으로 보고하였다. 그러나 아직까지 Rb1이 염증성 호흡기 질환의 호전에 미치는 영향과 명확한 기전에 대한 확인이 부족한 실정이다.
점액유전자는 TGF-β1과 IL 등의 다양한 사이토카인과 lipopolysaccharide(LPS)와 같은 외부독성물질에 의해 과발현 유도되는 것으로 보고되고 있다[15,19-21]. 본 연구진이 사포닌의 점액 과분비 억제효과를 확인하기 위해 시행한 이전 연구에서도 LPS에 의해 MUC5AC 점액 유전자의 과발현이 유도되었으며, 사포닌의 성분 중 하나인 protopanaxadiol이 활성화 산소의 억제를 통해 LPS에 의해 유도된 MUC5AC의 과 발현을 줄인다는 것을 확인할 수 있었다[15]. 본 연구에서도 NCI-H292 세포에서 TGF-β1의 유도된 MUC4/5AC 점액유전자의 과발현을 Rb1이 의미있게 억제함을 확인할 수 있었으며, 이는 중요한 염증성 호흡기질환 치료제인 dexamethasone과 유사한 정도의 억제효과가 있음을 확인할 수 있었다.
기도 상피세포는 다양한 사이토카인과 외부독성물질들에 의해 세포 연접 구조가 손생될 때 상피-중간엽 전이가 관찰되고, 이때 다양한 세포 결합 단백들의 발현변화가 관찰된다. 상피-중간엽 전이 때는 occludin, claudin 18, E-cadherin, ZO-1, cytokeratin과 같은 세포결합 단백들의 발현억제가 관찰되며, claudin 4, N-cadherin, fibronectin, vimentin과 같은 단백들의 발현의 증가가 나타난다[5-7]. 최근 다양한 연구에서 상피-중간엽 전이가 천식과 만성폐쇄성 폐질환과 같은 염증성 호흡기 질환의 악화에 중요한 병인으로 보고되고 있다[7-9,22,23]. Hackett [7]은 외부물질의 노출로 인해 발생한 성장인자, 염증성 사이토카인, 모세포 단백질(matricellular protein) 등이 상피-중간엽 전이를 유발하며 이러한 과정이 천식환자의 기도 리모델링의 원인 중 하나로 보고하였으며, Hou 등[8]은 최근 연구들의 리뷰를 통해 흡연으로 인해 유발되는 만성폐쇄성 폐질환과 폐암의 중요한 발병기전으로서 상피-중간염 전이의 중요성을 보고하였다. 최근 TGF-β1에 의해 유도되는 상피-중간엽 전이를 억제 할 수 있는 물질들에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있으며, 항염증제로서 효과가 알려진 dexamethasone이 TGF-β1에 의해 유도된 상피-중간엽 전이를 억제하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다[11,22-25]. 본 연구에서도 NCI-H292 세포에서 TGF-β1에 의해 유도된 상피-중간엽 전이 과정 중 억제되는 ocluddin, claudin 18, E-cadherin mRNA와 단백 생성을 유의하게 증가시켰고, TGF-β1에 의해 유도된 상피-중간엽 전이 과정 중 유도되는 claudin 4, N-cadherin mRNA와 단백 생성을 유의하게 억제하였다. 이를 통해 TGF-β1에 의해 유도된 상피-중간엽 전이를 Rb1이 효과적으로 억제할 수 있음을 확인할 수 있었다.
본 연구에서 우리는 Rb1이 TGF-β1에 의해 유도된 MUC4/5AC 과발 및 상피-중간엽 전이 관련 세포연접 단백들의 발현을 의미있게 조절한다는 것을 확인할 수 있었다. 이는 염증성 호흡기 질환의 새로운 치료제로서의 Rb1의 가능성과 스테로이드의 대체약제로서의 가능성을 모두를 보여준 결과로 생각된다. Rb1의 항염증 효과의 관련 기전으로는 면역 염증 반응의 주요 조절 인자인 nuclear factor-kappa B(NF-kB)의 활성화와 mitogen-activated protein kinases(MAPKs)의 활성화에 대한 억제효과로 생각해볼 수 있으며[11], 이는 스테로이드의 항염증 효과의 관련기전으로도 알려져 있다[22,23]. 또한 다양한 MAPKs와 NF-kB의 활성화는 점액 유전자 과발현과 EMT 발생의 중요 조절 기전으로도 알려져 있어 Rb1의 MAPKs와 NF-kB의 활성화 억제를 통해 점액 유전자의 과발현과 EMT 반응의 억제를 유도하는 것으로 생각해볼 수 있다[26,27]. 그러나 Rb1이 점액 과분비 조절억제의 정확한 기전과 위치를 확인하기 위해서는 air-liquid interface 기법 또는 ex vivo 법을 이용한 추가 실험이 필요할 것으로 생각되며, 세포-중간엽 전이 조절 효과에 대한 상세한 기전에 대한 추가 연구도 필요할 것으로 생각된다. 또한, Rb1의 복용량과 혈중 농도에 대해 동물실험 및 임상연구를 통한 추가 연구도 필요할 것으로 생각된다.
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