| Ki-67 Index in the Head and Neck Squamous Cell Carcinomas and Tumor Adjacent Epithelia. |
| Geon Choi, Kang Mok Yoo, Dong Hee Yoo, Sung Won Chae, Kwang Yoon Jung, Jong Ouck Choi |
| Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, College of Medicine, Korea University, Seoul, Korea. KUGHORL@nuri.net |
| 두경부 편평세포암종과 종양주변 점막에서의 Ki-67 표지지수 |
| 최 건 · 유강목 · 유동희 · 채성원 · 정광윤 · 최종욱 |
| 고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실 |
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| 주제어:
두경부편평세포암종ㆍKi-67 표지지수ㆍ면역조직화학염색. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Prognostic information is essential for the evaluation, judgement and optimal treatment of patients with head and neck squamous cell carcinoma. To evaluate the biological behavior of the malignancy, in particular, the proliferative activity of tumor cells were analyzed by proliferative markers, such as the Ki-67 index, PNCA and AgNOR. We performed this study to draw correlations between clinical findings and histopathologic prognostic factors using the Ki-67 index in the tumor tissues and the tumor adjacent epithelia.
MATERIALS AND METHODS:
The Ki-67 index of tumor tissues and the tumor adjacent epithelia from 24 patients with head and neck squamous cell carcinoma were analyzed using immunohistochemical methods. The relationships between the Ki-67 index in tumor tissues and tumor adjacent epithelia and several host and tumor factors were analyzed.
RESULTS:
The median Ki-67 index was higher in the tumor tissues than in the tumor adjacent epithelia (p<0.001). The ki-67 index of tumor tissues or tumor adjacent epithelia was not correlated with any host or tumor factor except N stage with tumor of interval to any treatment failure among the five variables which includes Ki-67 index, T stage, N stage, AJCC stage and age. Media interval to any treatment failure was shorter in groups with a high Ki-67 index than in groups with a low Ki-67 index of tumor tissue, but this result was statistically insignificant.
CONCLUSION:
The Ki-67 index was of little values in prognosis. However, among the various markers such as, the Ki-67 index, T stage, N stage, AJCC stage and age, the Ki-67 index of tumor tissue was the most significant predictor of interval to any treatment failure. |
| Keywords:
Head and neck cancerㆍSquamous cell carcinomaㆍKi-67 indexㆍImmunohistochemical study |
서론
두경부암은 우리나라에서 전체암으로 인한 사망률중 2.7%를 차지하고1) 미국에서는 전체 암의 발생률 중 5%를 차지하는 암으로2) 수술적 치료 후에는 급격한 미용상 변화 및 기능적 기형과 영양부족 등의 문제들을 야기하여 그 질환의 중요성이 높게 평가되고 있다. 특히 최근의 항암 화학요법 및 방사선 치료 등 보조치료법의 발달로 정확한 예후의 예측이 필요하게 되었으나 임상적 병기 및 조직병리학적 분화도 등 기존의 예후인자로는 충분하지 않다는 것이 밝혀졌다.3) 따라서 예후 예측을 보완하기 위하여 악성 종양의 생물학적 동태를 알고자 종양 조직을 이용하여 DNA 유세포분석(flow cytometry), Ki-67 표지지수,4-9) 증식핵항원(P-CNA), 4-6) AgNOR 10) 등 종양세포의 증식 능력을 평가하는 여러 연구가 시도되고 있다.
Ki-67 표지지수에 대한 연구에는 면역조직화학적 염색을 위해 동결절편을 이용하여 왔으나 1991년 Ki-67 유전자의 cloning 및 sequencing에 성공하여 새로운 단클론항체의 생산에 성공하여 파라핀에 포매된 조직에서도 실험이 가능하게 되었다.11)
본 연구에서는 수술적 치료를 시행한 두경부 편평세포암종에서 종양 조직과 종양주변 정상점막에서 Ki-67에 대한 면역조직화학적 염색을 시행, 종양의 증식 정도를 보는 표지자를 구하여 여러가지 임상적 소견 및 조직병리학적 예후인자 들간의 상관관계를 비교하고자 하였다.
재료 및 방법
대상 및 재료
두경부 편평세포암종으로 진단받고 수술적 치료를 우선적으로 시행한 환자로 최소 3년간 추적관찰이 가능하였으며 파라핀 포매조직의 이용이 가능한 35명의 환자에서 시행하였으나 이중 탈석회화 과정을 거쳐 Ki-67 염색정도를 파악 할 수 없던 후두암 11례는 결과분석에서 제외하고 24 명에 대하여 분석하였다. 환자의 임상적 정보는 의무기록, 병리보고서 및 적출된 조직병리 표본을 사용하였다. 임상적 정보로는 성별, 연령, 원발종양의 병기(T stage), 경부전이의 병기(N stage), AJCC(American Joint Committee on Cancer) 병기, 조직병리학적 분화도, 재발여부 등을 조사하였다.
연구재료는 대상 예에서 수술중 체취한 조직을 통상적인 포르말린 고정과 파라핀 포매를 거친후 hematoxylin-eosin 염색을 시행하여 조직병리학적 형태를 재평가한 종양조직과 종양주변의 점막을 이용하였다.
면역조직화학 염색
파라핀 포매조직은 4 m 두께의 절편으로 만들어 양전하를 띤 슬라이드(ProbeOn Plus Microscope Slides, FisherBiotech(r), USA)에 부착시키고 60℃ 오븐에서 건조시킨 후 xylene에 처리하여 탈파라핀 시키고 100%, 95%, 90%, 80% 알코올, 증류수의 순서로 함수 처리 후 실온에서 건조시켰다. 슬라이드를 pH 6.0 citric acid용액에 담가 자동 고압멸균기에서 121℃로 15분간 가열한 다음 15분간 상온에서 식히고 tris 완충액에서 중화시키고 정상 말 혈청을 가하여 실온에서 15분간 방치하였다. 내인성 과산화효소를 억제시키고 일차 마우스 단클론 항체의 비특이적 결합을 감소시키기 위해 3% H2O 2-methanol 용액에 5분간 처리한 후 tris 완충액으로 수세하였다. 1：50으로 희석한 Ki-67에 대한 단클론항체(clone：7B11)를 실온에서 2시간동안 반응 후 수세하였다. 시료에 biotinylated secondary antibody(Histostatin TM SP kit, Zymed Lab. Inc.)를 가한후 20분간 실온에서 반응시키고 재차 수세하여 streptoavidin-peroxidase(Histostatin TM SP kit, Zymed Lab. Inc.)를 가해 15분간 반응시킨 후 tris 완충액으로 수세하였다. AEC(3-amino-9-ethyl-carbazol, Zymed lab. Inc., USA)로 발색시킨 다음 Harris-hematoxylin으로 대조 염색하고 봉입하였다.
Ki-67양성인 종양세포의 수는 400배 시야에서 염색된 세포들의 밀도가 가장 높은 부위를 찾아 3∼5개의 다른 부위를 사진 촬영한 후 종양세포를 500개 이상 세어서 이중 뚜렷하게 적갈색의 과립형으로 염색된 핵의 수를 백분율로 하여 Ki-67 표지지수를 구하였다. 종양주변 점막에서의 Ki-67 표지지수도 유사한 방법으로 구하였다.
통계학적 분석
종양의 치료실패기간은 수술일로부터 국소재발, 경부재발, 원격전이, 이차암 발생 등 치료실패가 발견될 때까지의 기간으로 하였다. Ki-67 표지지수의 연속형 자료에 대한 각 환자군의 특성 중 나이(60세 미만 대 60세 이상), T병기(T1, 2 대 T3, 4), N병기(N0 대 N1-3), AJCC병기(I, II 대 III, IV)는 범주형 자료의 형태를 취하였으며 p값은 student t-test에 의하여 산출하였다. 종양의 원발부위(후두, 혀, 하인두, 기타)에 따른 p값은 최소제곱평균법(LS-MEAN)을 이용한 t-test를 사용하였으며 유의수준은 95 %로 정하였다. 치료실패상대위험률(relative risk ratio)은 Cox 비례위험모형에 의해 그리고 치료 실패 기간에 따른 비교는 Kaplan-Meier 방법에 따라 산출하였다. 두 그룹간의 개체수의 차이가 현저한 성별 및 종양의 조직병리학적 분화도에 따른 종양조직 및 종양주변 정상점막에서의 Ki-67 표지지수의 통계학적 분석 및 원발병소에 따른 정상점막에서의 Ki-67 표지지수의 통계분석, 정상점막에서의 Ki-67 표지지수에 고저에 따른 치료실패 상대위험율과 치료실패기간의 비교는 종양주변 점막에서의 Ki-67 표지지수가 각 환자별로 유의한 차이가 없어 결과에서 제외하였다.
결과
종양조직과 종양주변 점막에서 Ki-67 표지지수의 비교
종양내 Ki-67 표지지수는 14.9∼70.0%까지 넓은 분포를 가졌으며 평균은 29.8±12.8%이고 중앙값은 27.8%이었고(Fig. 1A), 종양주변 점막에서의 Ki-67 표지지수는 0에서 2.4%까지 분포하였고 평균 0.63±0.68%이었고 중앙값은 0.42%으로(Fig. 1B) 종양조직의 Ki-67 표지지수가 종양주변 점막에 비해 높았다(p<0.001)(Table 1).
종양조직과 종양주변 점막에서 Ki-67 표지지수와 환자의 특성 비교
대상 환자의 연령은 35세부터 86세 사이로 60세 미만이 11명, 60세 이상이 13명이었고 평균연령은 60.1세이었다. 연령별(60세미만 대 60세 이상), T병기(T1, 2 대 T3, 4), N병기(N0 대 N1-3), AJCC병기(I, II 대 III, IV), 재발 유무, 원발병소의 위치에 따른 종양조직과 종양주변 점막에서의 Ki-67 표지지수의 차이는 N 병기에 따른 종양주변 점막에서의 Ki-67 표지지수를 제외하고는(p＝0.03) 모두 유의한 차이가 없었다(Table 1).
원발병소의 위치에 따른 종양조직의 Ki-67 표지지수는 하인두에서 41.0%로 28.1%에서 28.2%의 표지지수를 보인 타 부위에 비해 높았으나 통계학적인 유의성은 없었다(Table 2). 성별(남자：22명, 여자：2명), 종양의 분화도(고도의 분화도：22례, 중증도의 분화도：2례)에 따른 Ki-67 표지지수의 차이는 개체수의 편중적인 차이 때문에 시행하지 않았다.
Ki-67지수와 치료실패 상대위험률(relative risk ratio)
Ki-67 표지지수가 높은 군(27.8% 이상)과 낮은 군(27.8% 미만)에 따른 치료실패 상대위험율은 0.2554로 0.9923을 보인 T병기(T1, T2 대 T3, T4), 0.9909를 보인 N병기(N0 대 N1-3), 0.9909를 보인 AJCC병기(I, II 병기 대 III, IV 병기), 0.7591을 보인 연령(60세 미만 대 60세 이상)에 비하여 가장 낮은 p값을 보였다(Table 3).
Ki-67 표지지수와 치료실패기간
치료실패까지 기간의 중앙값은 종양조직에서 Ki-67 표지지수가 낮은 군(Ki-67<27.8%)에서는 29.0개월, Ki-67 지수가 높은 군(Ki-67 지수>27.8%)에서는 11.0개월로 Ki-67 지수가 높은 군에서 치료실패가 빨랐으나 통계적 유의성은 없었다(p＝0.2351)(Fig. 2).
고찰
현재 사용하고 있는 종양의 크기가 주가 되는 임상적 병기는 생존율, 치료에의 반응 그리고 종양의 침윤성 등을 예측할 수 있어야 하지만 동일한 임상적 병기에 포함된 많은 두경부암이 서로 다른 성장 양상이나 예후를 나타낼 수 있다.6) 또한 조직병리학적 분화도가 주가되는 기존의 고전적인 조직병리학적 양상도 치료결과 및 재발예측에 큰 도움을 주지 못하였다. 그러나 종양의 두께, DNA양과 세포의 증식력을 포함한 빠른 종양의 성장은 여러 인체 암에서 나쁜 예후를 보인다고 보고되었다.6) DNA 합성기의 지표로서 in vitro thymidine labelling index(TLI), image cytometry나 flow cytometry에 의한 S기의 분획 측정, 그리고 면역조직화학적 염색에 의한 증식세포의 측정은 DNA 합성기에 있는 세포들의 분획을 나타내는 지표들이다. 자가방사기록법에 의한 thymidine labelling은 시행하는데 10일 이상 많은 시간이 소요되고 많은 양의 종양조직이 필요하며 정상 이배체세포나 세포의 파편에 의해 오염될 수 있고 tritium같은 긴 반감기를 갖는 방사성 동위원소를 사용하므로 모든 실험실에서 시행하기 어려운 단점들이 있다. 12) 또 cytometry에 의한 DNA 함량분석은 이배수체 종양에서는 정확하지 않은 단점이 있어 이들의 임상적 가치들은 제한적일 수밖에 없었다.6)
최근의 면역조직화학적 방법에 의한 증식세포의 측정은 간단하고 조기에 결과를 확인할 수 있는 장점이 있으며 이러한 세포의 증식능을 측정할 수 있는 여러가지 단클론 항체로서 Ki-67 항체, PCNA, anti-ribonucleotide reductase, anti-DNA polymerase alpha, anti-C5F10, anti-BrdU, anti-M phase specific 단클론 항체 등이 있다. 이중 증식기 세포에 염색되는 Ki-67 단클론 항체를 사용한 Ki-67 표시지수는 특징적으로 세포의 증식능을 알 수 있다.6-9) 1983년 Gerdes등13)이 개발한 Ki-67 단클론항체는 호즈킨병환자의 Reedsternberg 세포에 있는 핵 항원을 쥐에 면역시킨 후 분리한 것으로 세포주기 중 후기 G1기, S, G2, M기에 발현하는 비히스톤성 단백인 395와 345kD의 핵항원을 감지할 수 있으며 이 항원은 G0기에서는 발현되지 않으므로 면역조직화학염색을 시행하면 종양세포의 증식능을 간편하고 신속하고 객관적으로 측정할 수 있다. 이 단클론항원의 개발 당시에는 신선한 조직을 이용한 동결절편에만 염색을 시행할 수 있었으나 최근 파라핀 포매조직을 가열 처리후 염색할 수 있는 Ki-67 단클론 항체가 소개되어 후향적 검사도 가능하게 되었다.11) 특히 극초단파로 가열 처리하면 세포외형을 보존하고 강한 면역 반응을 유발시키며 양성세포와 음성세포의 구별을 명확히 할 수 있고 대부분의 조직병리 실험실에서 간단하게 시행할 수 있다는 장점이 있다. Ki-67은 종양조직에서 뿐만이 아니고 증식기에 있는 정상조직에서도 발현되는데 임파절의 배중심(germinal cencer), 표피 배중심(epidermal germinal center), 장음와세포(intestinal crypt cells), 미분화된 정조세포(undifferentiated spermatogonia), 흉선, 편도선 등에서 정상적으로 관찰된다.11)
면역조직화학적 염색에 의한 Ki-67 표지지수는 여러 종양들에서 연구되었다. Gasparini등 12)은 유방암에서 Ki-67 표지지수가 조직병리학적 분화도와 생존율에 유의한 상관관계가 있다고 보고하였다. 그러나 다른 보고들에서는 Ki-67 표지지수가 유사 핵분열지수나 조직병리학적 분화도와는 유관하나 종양의 크기나 림프전이의 유무와는 무관하다고 하였다.14)15) Porschen등16)은 대장직장암에서 Ki-67 표지지수를 측정하였는데 종양의 부피, 성별, 나이, 조직병리학적 분화도 및 종양의 병기와 무관하며 전체 환자의 Ki-67 표지지수의 평균은 38.7%이었으나 재발한 예에서 47.1%의 높은 Ki-67 표지지수를 보였다고 보고하였다. 이러한 보고는 본 연구에서 Ki-67 표지지수가 높은 군에서 치료실패가 빨랐던 결과와 부합된다고 할 수 있다. Brown등18) 은 자궁경부 편평세포암종에서 Ki-67 표지지수와 기존의 조직학적 지표들 즉 세포유형, 종양의 분화도 등과 유의한 차이가 없음을 보고하였다. 본 연구에서는 종양의 분화도에 따른 Ki-67 표지지수는 고도의 분화도를 보인 예가 22례, 중등도의 분화도를 보인 예가 2례로 대부분의 예가 고도의 분화도를 보여 시행하지 않았다.
두경부암에 대한 Ki-67을 이용한 연구는 다른 장기의 암 즉 유방암이나 대장직장암에서처럼 많은 연구가 진행되지 않았다.4)5)7)9) Zheng등7)은 비인강암에서 Ki-67 표지지수가 N병기 및 임상적 병기와 유의한 연관성이 있었고, 정상 비인두점막과 비인강암의 Ki-67 표지지수를 비교한 결과 비인강암에서 유의하게 높았으나 나이, 성별, T병기에 따른 Ki-67 표지지수의 통계학적 유의성은 없었다고 보고하였다. Roland등4)의 연구에 의하면 79명의 두경부암환자에서 Ki-67 표지지수와 조직학적 병기, 나이, 성별, T병기, N병기, 재발까지의 기간, 생존율과 유의성이 없음을 보고하였다.
본 연구에서는 종양조직의 Ki-67 표지지수가 종양주변 점막에 비해 높았고, Ki-67 표지지수와 환자의 특성 즉 연령별(60세미만 대 60세 이상), T병기별(T1, 2 대 T3, 4), N병기별(N0대 N1-3), AJCC병기별(I, II 대 III, IV), 재발 유무 및 원발병소의 위치에 따라 종양조직과 종양주변 점막의 Ki-67 표지지수를 각각 비교한 결과 그 차이는 N 병기에 따른 종양주변 점막에서의 Ki-67 표지지수를 제외하고는(p＝0.03) 모두 유의한 차이가 없었다. 원발병소의 위치에 따른 종양조직의 Ki-67 표지지수는 하인두에서 41.0%로 28.1%에서 28.2%의 표지지수를 보
인 타 부위에 비해 높았으나 통계학적인 의의는 없었다. 치료실패 상대위험율은 종양조직에서의 Ki-67 표지지수가 높은 군(27.8% 이상)과 낮은 군(27.8% 미만)에 따라 0.2554로 0.9923을 보인 T병기(T1, T2 대 T3, T4), 0.9909를 보인 N병기(N0 대 N1-3), 0.9909를 보인 AJCC병기(I, II 병기 대 III, IV 병기), 0.7591을 보인 연령(60세 미만 대 60세 이상)에 비하여 가장 낮은 p값을 보였으며 종양조직에서의 Ki-67 표지지수와 치료실패기간의 비교에서는 치료실패까지 기간의 중앙값은 종양조직에서 Ki-67 표지지수가 낮은 군(Ki-67<27.8%)에서는 29.0개월, Ki-67 지수가 높은 군(Ki-67 지수>27.8%)에서는 11.0개월로 Ki-67 지수가 높은 군에서 치료실패가 빨랐으나 통계적 유의성은 없었다.
Ki-67 단클론항체를 이용한 파라핀 포매조직을 이용할 때 극초단파로 가열처리한 경우 탈석회화나 색소탈실과정의 영향을 받지 않는다는 주장이 있었다. 그러나 본 연구에서는 전체 적출된 후두 조직 21례중 탈석회화를 시행한 11례 모두에서 핵의 염색양상을 구별할 수 없을 정도로 흐리게 염색되어 결과 분석에서 제외하였다. 염색된 핵의 분포는 각각의 종양내에서도 차이가 있는데 종양 island의 중앙부위는 성숙된 세포들과 각질화를 보여 보다 활동적으로 증식하는 주변부에 비해 더 적은 분포를 나타낸다.18) 본 연구에서도 자궁경부편평세포암18)이나 두경부편평세포암4)에서 같이 종양 island의 주변부에 Ki-67 염색세포들이 중앙부보다 밀집되어 있는 양상을 관찰할 수 있었다.
본 연구에서는 환자의 수가 적어 Ki-67 표지지수와 임상적 소견 및 치료실패기간 등 여러 인자에서 유의한 차이를 관찰하지 못하였으나 향후 보다 많은 환자를 대상으로한 연구가 필요할 것으로 생각되었다.
요약
두경부 편평세포암종에서 종양세포 및 종양주변 조직의 증식능력을 간접적으로 알기 위하여 Ki-67 항원에 대한 면역조직화학적염색으로 양성인 암종세포의 핵의 수를 백분율화하여 표지지수를 구하고 이를 각 예후인자 즉 연령, AJCC병기, T병기, N병기 등과 환자의 추적조사 결과로 얻은 재발률과의 상관관계를 비교하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
종양조직의 Ki-67 표지지수가 종양주변 점막에 비해 높았고, Ki-67 표지지수와 환자의 특성과 비교한 결과는 연령별(60세미만 대 60세 이상), T병기(T1, 2 대 T3, 4), N병기(N0 대 N1-3), AJCC병기(I, II 대 III, IV), 재발 유무, 원발병소의 위치에 따른 종양조직과 종양주변 점막에서의 Ki-67 표지지수의 차이는 N병기에 따른 종양주변 점막에서의 Ki-67 표지지수를 제외하고는(p＝0.03) 모두 유의한 차이가 없었다. 원발병소의 위치에 따른 종양조직의 Ki-67 표지지수는 하인두에서 41.0%로 타 부위에 비해 높았으나 통계학적인 의의는 없었다. 치료실패 상대위험율은 Ki-67 표지지수가 높은 군(27.8% 이상)과 낮은 군(27.8% 미만)에 따라 0.2554로 0.9923을 보인 T병기(T1, T2 대 T3, T4), 0.9909를 보인 N병기(N0 대 N1-3), 0.9909를 보인 AJCC병기(I, II 병기 대 III, IV 병기), 0.7591을 보인 연령(60세 미만 대 60세 이상)에 비하여 가장 낮은 p값을 보였으며 Ki-67 표지지수와 치료실패기간의 비교에서는 치료실패까지 기간의 중앙값은 종양조직에서 Ki-67 표지지수가 낮은 군(Ki-67<27.8%)에서는 29.0개월, Ki-67지수를 높은 군(Ki-67 지수>27.8%)에서는 11.0개월로 Ki-67이 높은 군에서 치료실패가 빨랐으나 통계적 유의성은 없었다.
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