Organotypic Culture of Organ of Corti with Floating Drop Method from Newborn Rat.

Cho, Chang Gun; Chung, Jong Woo; Kim, Hyo Joon; Lee, Kwang Sun

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 41(7); 1998 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1998;41(7): 823-829.

Organotypic Culture of Organ of Corti with Floating Drop Method from Newborn Rat.

Chang Gun Cho, Jong Woo Chung, Hyo Joon Kim, Kwang Sun Lee

¹Department of Otorhinolaryngology, Asan Medical Center, College of Medicine, University of Ulsan, Seoul, Korea. www.kslee2@amc.seoul.kr
²Korea Veterans Hospital, Seoul, Korea.

부유법을 이용한 신생 흰쥐 코르티 기관의 조직배양

조창건¹ · 정종우¹ · 김효준² · 이광선¹

울산대학교 의과대학 서울중앙병원 이비인후과학교실1;한국 보훈병원 이비인후과2;

주제어: 코르티 기관ㆍ조직배양ㆍ부유법.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Organotypic culture of organ of Corti maintains the basic organization of the spiral lamina and can conserve several factors responsible for the neuronal growth of the nervous components. The explant culture technique has been widely used in organ culture system, however, the floating drop method using collagen gel was also developed as a simple and reliable method. In order to study the effect of growth factors on the regenerative and protective ability of cochlear hair cells, we first had to establish an in vitro model of the inner ear.
MATERIALS AND METHODS:
Organ of Corti was obtained from newborn rats and cultured with the floating drop method using collagen gel. Immunohistochemical staining was used to visualize the stereocilia and scanning electron microscopic study was also carried out.
RESULTS:
Explants were maintained up to 10 days without contamination. Morphologically, immunofluorescent staining with phalloidin showed well preserved outer and inner hair cells with stereocilia on the second day of culture. On the tenth day of culture, the staining result showed inner and outer hair cells, although the stereocilia were poorly stained. In scanning electron microscopic examination, an explant on the tenth day of culture showed preserved outer and inner hair cells and stereocilia, although damaged hair cells and stereocilia were also observed.
CONCLUSION:
The floating drop method was an appropriate method for maintaining the organ of Corti in vitro with the advantage being the easiness in its manual manipulation.

Keywords: Organ of cortiㆍOrgan cultureㆍFloating drop methodㆍScanning electron micrographyㆍPhalloidin

서론 포유류의 내이 유모세포는 임신 초기에 분화가 완료되어 출생시에는 이미 완성된 내이구조를 가지고 있다. 따라서 이후 발생되는 유모세포의 소실 혹은 손상에 의한 청각 장애는 영구적이며 불가역적인 현상으로 알려져 있으며, 사람에서도 유모세포의 소실에 의한 감각 신경성 난청은 근본적인 치료가 불가능한 것으로 여겨졌다. 하지만 유모세포의 재생에 대한 연구는 최근 면역조직학, 분자생물학 등의 발전과 말초 청력기관인 코르티 기관의 조직배양이 가능해짐에 따라 그 기초가 마련되었으며 손상 유모세포의 치료의 가능성도 제시되게 되었다. 조직배양(organotypic culture)은 시험관내 실험(in vitro)에서 생화학, 면역조직화학, 분자생물학 등을 이용하여 세포의 발달과정에 관여하는 제반 기전에 대한 연구를 할 수 있는 좋은 방법이다. 코르티 기관의 조직배양은 내이의 감각 유모세포를 장기적으로 유지하면서 관찰할 수 있으며 유모세포의 발달과정에 있어 성장요소들의 효과 및 기전을 밝혀낼 수 있는 방법으로 나선판(spiral lamina)의 기본 구조를 유지함으로써 세포간의 관계 및 신경조직의 성장에 필요한 요소들을 보존할 수 있다.1) 조직배양의 방법은 Friedmann13)에 의한 체외이식(explant) 배양법이 1962년 보고된 이후 이 방법이 널리 이용되었으며 1993년 Rastel 등14)은 기존의 체외이식 배양법에 비해 빠르고 간편한 방법으로 콜라젠 층위에 조직배양하는 방법을 보고하였고 이를 부유법(floating drop method)이라 하였다. 본 연구에서는 Rastel 등14)이 보고한 부유법을 이용하여 신생 흰쥐 코르티 기관의 조직배양을 하여 이 방법의 유용성을 알아보고자 하였다. 또한 부유법을 이용한 조직배양 후 유모세포의 보존을 확인하기 위하여 소피판(cuticular plate)과 부동섬모(stereocilia)의 세포 골격 성분인 F-actin에 대한 특정 탐식자(specific probe)인 phalloidin15)으로 조직화학적 염색을 시행하였고, 주사 전자현미경(scanning electron micrography)을 통하여 코르티 기관의 표면 미세구조를 관찰하였다. 재료 및 방법 코르티 기관의 분리 및 배양을 위한 실험동물로 신생 흰쥐(Sprague-Dawley rats)를 이용하였다. 신생 휜쥐를 -20℃에서 10분간 냉동 마취(cryo-anesthesia) 시킨 후 70%의 에탄올로 소독한 후 경부를 절단하여 두부를 분리하였다. 두피를 제거한 후 37℃ Hanks’ balanced salt solution(HBSS)(Sigma, St. Louis, MO, USA)이 담긴 petri dish에서 입체 현미경 (stereomicroscope) 하에 정중선을 따라 두부를 절단하고 대뇌와 소뇌를 제거하였다. 측두골에서 내이를 주위 조직으로부터 분리하고 37℃ minimum essential medium(MEM)(Sigma)이 담긴 petri dish로 옮긴 후 와우 축신경(modiolar nerve)을 제거하고 내이혈관조층(stria vascularis)을 구분해 분리하였다. 분리된 나선판(spiral lamina)을 세 부분(첨단부, 중간부, 기저부)으로 나누고 부유법(floating drop method)에 의한 배양을 시작하였다. 부유법은 Bornstein 16)의 방법에 의하여 쥐의 꼬리에서 분리한 collagen type I(Sigma)을 기질로 이용하였다. 콜라겐을 riboflavin 5’ phosphate(Sigma)와 5：1의 비율로 섞은 후 배양액이 담긴 24 wall Falcon dish에 천천히 떨어뜨렸다. 배양액으로는 15% fresh horse serum(Sigma), 50% MEM buffered with 5mM Hepes(Sigma), 29% HBSS, 2.6%의 0.25 M L-glutamine(Sigma) HBSS용액 그리고 20% glucose가 포함된 3.4% HBSS용액을 배합하여 사용하였다. 30μL의 콜라겐 용액을 Falcon dish에 천천히 떨어뜨린 후 700μL의 배양액을 채우고 그 위에 분리한 코르티 기관을 올려놓았으며 그 주위로 4곳의 wall에는 HBSS 1000μL를 넣어 24 wall Falcon dish를 완성하였다(Fig. 1). 37℃, 5% CO 2 배양기에서 조직배양을 하였으며, 2일 간격으로 배양액을 교체하였다. 배양액을 교체하기전 입체 현미경 하에서 배양액의 색, 조직의 모양, 증식 등을 관찰하였으며, 배양액 교체시 콜라겐 층이 교란되지 않도록 주의하였다. 유모세포의 보존 여부와 미세구조의 관찰을 위하여 fluorescein isothiocyanate(FITC) phalloidin(Sigma)을 이용하여 F-actin에 대한 형광염색과 주사 전자현미경 관찰을 시행하였다. Phalloidin 염색은 먼저 4% paraformaldehyde로 조직을 고정시킨 후, FITC-phalloidin 1.0 μg/ml와 1시간 동안 실온의 암실에서 반응시키고 PBS로 두번 처리한 후 slide glass에 mounting한 후 형광 현미경으로 관찰하였다. 코르티 기관의 주사 전자현미경을 통한 형태학적 관찰을 위해 배양 2일째와 10일째 각각의 코르티 기관을 2.5% glutaraldehyde로 4에서 3시간 고정시킨후 0.1M PBS로 10분간 3회 세척하였다. 1% osmium tetroxide에 1시간 30분간 다시 고정한 다음 50%부터 100%까지의 알코올을 이용한 탈수과정을 거쳐 임계점(critical point)에서 조직을 건조시킨후 금도금하여 관찰하였다. 관찰은 주사 전자현미경(SEM-820, Jeol, Tokyo)으로 유모세포의 표면 미세구조의 변화를 관찰하였다. 결과 코르티 기관을 분리해 첨단부, 중간부, 기저부 세 부분으로 나눈 후 배양액 위의 콜라겐 층에 올려놓은 후 현미경으로 관찰하였을 때, 유모세포층과 신경섬유층이 잘 조직화된 모습으로 관찰되었다(Figs. 2 and 3). 부유법에 의한 배양 결과 추출물은 배양 10일째까지 손상되지 않은 상태로 그 형태를 유지하였다. 이는 입체 현미경 하에서 추출물의 밝고 얇은 조직화된 모습의 보존으로 확인할 수 있었다. 섬유모세포(fibroblast)는 배양 첫 1일부터 관찰되기 시작하였고 대식세포(macrophage)는 배양 4일째부터 추출물의 주위로 관찰되었다. 콜라겐 젤이 유지되지 않아 추출물이 Falcon dish 바닥에 가라앉은 경우 추출물의 섬유모세포의 증식은 억제되었다. 또한 추출물이 콜라겐 층에 말려들어가 접히는 경우도 코르티 기관의 생존상태의 여부를 관찰하기가 곤란하였는데, 이러한 경우를 제외하고는 코르티 기관의 구조가 잘 보존된 상태로 배양이 유지되었다. 코르티 기관을 첨단부, 중간부, 기저부의 3부분으로 나누어 관찰하였을때, 대부분의 경우 중간부와 기저부에서는 형태가 잘 보존되었으며 배양 10일째까지 배양이 유지되었으나, 첨단부에서는 상대적으로 배양기간이 짧아 배양 6일째까지만 형태가 보존되는 경우가 많았으며 배양 10일째까지 유지된 경우는 드물었다. 형광 염색으로 유모세포의 보존을 확인하기 위하여, 배양 2일째의 추출물을 대조군으로 하여 면역 형광 현미경으로 관찰하였다. 3열의 외유모세포와 1열의 내유모세포가 정돈되어 배열된 양상을 보였으며 각각의 유모세포에서는 부동섬모가 관찰되었다(Fig. 4). 배양 10일째의 조직을 형광 염색하였을 때의 결과도 외유모세포와 내유모세포가 잘 유지되어 관찰되었다. 입체 현미경상에서 관찰한 조직의 형태 보존의 정도에 비례하여 형광 염색 결과도 다양하게 나타났지만 일반적으로 대조군에 비해 부분적으로 소실된 유모세포와 정돈되지 않은 배열을 관찰할 수 있었다(Fig. 5). 코르티 기관을 3부분으로 나누어 관찰하였을 때, 배양 2일째와 배양 10일째 모두 기저부, 중간부, 첨단부에서 유모세포 염색상의 차이는 관찰되지 않았다. 주사 전자현미경을 통하여 관찰한 결과 배양 1일째 코르티 기관에서는 1열의 내유모세포와 3열의 외유모세포가 잘 정돈된 배열을 관찰할 수 있었으며 각각의 유모세포에서는 보존된 부동섬모가 관찰되었다(Fig. 6). 배양 10일째 Corti 기관의 주사 전자현미경 결과는 phalloidin 형광 염색 소견과 마찬가지로 부동섬모가 모두 잘 보존된 내유모세포와 외유모세포가 관찰되었다. 그러나 배양 10일째 조직은 배양 2일째의 Corti 기관의 주사 전자현미경 소견에 비해, 부분적인 유모세포의 결손과 함께 손상되어진 부동섬모가 관찰되었다(Fig. 7). 고찰 코르티 기관의 배양은 청각기관의 손상후 재생이나 회복에 대한 연구를 위한 기초적인 연구로서의 의의를 가진다. 1925년 Maximov2)에 의한 첫 실험이후 많은 시도가 이루어져, 1928년 Fell3)에 의해 병아리의 배아 이포(embryo otocyst)에서 처음 성공하였으며 Friedmann4)5)은 이포(otocyst)의 감각구조와 신경조직의 발달 및 신경지배를 연구 보고하였다. 그후 Orr6)나 Iwai7)는 시험관내 실험에서 병아리 나선 신경절(spiral ganglion)을 장기간 배양할 수 있음을 보고하였다. 조류 및 포유류 이포의 배양으로부터 발전되어 Van De Water8-10)는 생쥐를 이용한 이포의 단독 배양에 관한 연구를 체계적으로 시도하여 장기간의 시험관내 실험 모델을 확립함으로써 포유류 내이의 조직배양이 내이 질환으로 초래되는 청각 장애를 연구하는데 있어서 중요한 도구임을 보고하였다. 이후 Sobkowicz등11)은 신생 흰쥐로부터 몇주간 나선판(spiral lamina)의 조직 구조(organotypic structure)를 유지시켰으며 Russell 등12)도 신생 흰쥐로부터 나선판 및 내, 외 유모세포 배양의 성공을 보고하였다. 1962년 Friedmann13)에 의한 체외이식 배양법은 분리된 코르티 기관을 기저부, 첨단부 등으로 절단한 후 cell tak으로 덮힌 glass bottom microwell에 부착시킨후 배양액을 넣어 배양하는 방법으로, 이러한 체외이식 배양법에 의해 9일에서 13일까지 정상 배양이 가능하다고 보고되고 있다.17) 본 연구는 1993년 Rastel등 14)에 의해 처음 보고된 부유법(floating drop method)을 이용하여 10일까지 코르티 기관을 배양하였다. 부유법은 체외이식 배양법에 비해 배양과정이 간편하고, 시간이 절약되는 빠른 방법이다. 배양액외에 multi-wall Falcon dish와 콜라겐만이 배양에 필요한 부유법에 비해 체외이식 배양법은 coverslip, wax, 그리고 배양기의 부착물질 즉 세포외 기질물 등이 필요하며, 또한 배양기의 살균과정이 필요하다. 하지만 부유법은 규격화, 상품화된 multi-wall Falcon dish를 이용함으로써 살균과정이 필요없으며, 또한 동시에 많은 조직을 배양할 수 있어 시간을 절약할 수 있다. 본 연구에서는 24 wall Falcon dish를 이용하여 동시에 12개의 조직을 배양할 수 있었다. 하지만 부유법에 의한 배양은 코르티 기관이 콜라겐 층에 말려들어가 접혀 유모세포의 관찰이 곤란하게 되는 경우와, 조직이 콜라겐 층 위에 유지되지 못하고 가라앉은 경우가 있다는 단점이 있다. 배양기간에 있어서 본 연구에서는 10일간 배양이 가능하였고 최근의 보고에 의하면 10일에 서 12일까지 배양이 가능하다고 보고되고 있다.17)18) 부유법으로 조직배양을 처음 시도한 Rastel등14)의 연구에 의하면 최고 12일까지 조직 배양이 가능하였다고 한다. 조직 배양의 기간, 즉 코르티 기관의 생존기간에는 여러 요소가 관여하겠으며 첫째로 코르티 기관을 분리하는 과정과 배양기에서 배양하는 과정을 들 수 있다. 모든 과정은 소독된 시설에서 소독된 기구로 이루어져야 하며, 배양하는 과정에서도 오염되지 않도록 하여야 한다. 코르티 기관이나 배양액이 소독되지 않은 기구나 외부에 노출되었을 경우 배양 1일후 세균의 증식과 조직의 괴사를 관찰할 수 있었다. 둘째, 또 하나의 중요한 요소로 배양액을 들 수 있다. 본 연구에서는 Rastel등14)의 조직배양에 사용된 배양액과 동일한 구성의 배양액을 사용하여 배양을 유지하였다. 코르티 기관의 배양 및 유모세포 소실후 재생에 대한 연구에 있어서 다양한 종류의 배양액이 사용되어 왔으며 혈청 단독의 배양액보다는 여러 요소들을 조합한 배양액이 주로 이용되었다. 최근에는 세포의 증식을 촉진시키는 요소로 특히 인슐린이 중요한 것으로 취급되고 있어 이독성에 대한 방어나 재생에 대한 연구에 인슐린이 포함된 배양액이 사용되고 있다.18) 배양 최대기간의 연장이 성장인자의 효과와 작용을 확인하는 연구에 있어서 중요한 요소가 되므로, 보다 적합한 배양액의 개발이 필요하다고 하겠다. 코르티 기관을 첨단부, 중간부, 기저부의 세부분으로 나누어 배양을 하였을 때, 첨단부에서의 배양이 중간부나 기저부의 배양보다 결과가 좋지 않았다. 이에 대한 원인으로는, 먼저 분리과정에서 첨단부의 나선판이 기저부나 중간부에 비해 크기와 직경이 작아 내이혈관조층(stria vascularis)을 완전히 구분해 박리 및 절단하기가 어렵고, 둘째로 첨단부의 나선판은 작은 크기로 인하여 콜라겐 층에 말려들어가거나 유지되지 못하고 가라앉는 빈도가 기저부나 중간부에 비해 높았다. 첨단부가 중간부, 기저부에 비해 이독성 약물 처리시 형태를 잘 유지한다는 연구 보고도 있으나17) 본 연구에서는 분리과정에서의 영향과 콜라겐을 이용한 배양법의 차이로 반대의 배양 결과를 보였는데, 이에 대한 추후 연구가 필요하다고 생각된다. 유모세포의 보존을 확인하기 위하여 phalloidin으로 염색을 시행한 결과, 배양 2일째 조직에서는 3열의 외유모세포와 1열의 내유모세포가 정돈되어 배열된 양상을 보였으며 유모세포에서는 소피판(cuticular plate)과 부동섬모(stereocilia)가 잘 보존되어 관찰되었다. 배양 10일째의 조직을 phalloidin 염색하였을때의 결과는 입체 현미경상에서 관찰한 조직의 형태 보존의 정도에 비례하여 phalloidin 염색 결과도 다양하게 나타났지만 대조군에 비해 유모세포는 부분적으로 소실되었으며 정돈되지 않은 배열을 일반적으로 관찰할 수 있었다. 이러한 소견은 주사 전자현미경으로 관찰한 결과와도 일치되며, 주사 전자현미경 관찰에서는 배양 10일째 코르티 기관의 유모세포가 배양 2일째에 비해 손상되어진 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 배양이 진행되는 과정에서의 유모세포와 부동섬모의 소실과 함께, 염색과정에 있어서 여러 단계를 거치는 동안의 조직에 대한 손상이 미치는 오차가 함께 작용하여 유모세포와 부동섬모의 소실이 나타났다고 볼 수 있다. 배양의 진행에 따른 유모세포 및 부동섬모의 소실에 대하여 타 연구보고에 의하면 배양 9일에서 10일째 부동섬모의 생존이 감소된다고 보고되고 있다.17) 배양액의 조건 및 배지에서 배양액을 교체하는 과정이나 염색, 고정, 관찰 단계 등 모든 실험 과정이 유모세포 및 부동섬모의 보존에 영향을 미칠 수 있으므로 이러한 과정에서의 조직에 대한 손상이 미치는 오차를 최소화함으로써 대조군에 대한 정확한 비교가 가능하며 이는 또한 유모세포의 재생에 대한 연구에 중요한 기초가 될 것으로 생각된 다. 결론 콜라겐 젤을 이용한 부유법은 시험관내 실험에서 코르티 기관의 연구에 있어서 간편하고 빠르며 많은 조직을 동시에 배양할 수 있는 방법으로, 체외이식 배양법과 더불어 코르티 기관의 조직배양 및 손상된 유모세포의 재생과 그 기전에 대한 연구에 유용하게 사용될 수 있다. 본 연구에서는 부유법을 이용하여 10일간 코르티 기관의 배양을 유지하여, 코르티 기관의 정상 조직배양을 유지하고 형태학적 변화를 관찰하는 연구에 있어서 부유법이 이상적인 방법임을 알 수 있었다. 또한 FITC-phalloidin을 이용한 면역 형광 염색과 주사 전자현미경 관찰은 유모세포의 보존과 부동섬모를 확인할 수 있는 빠르고 간편한 방법으로 코르티 기관의 조직배양 및 손상된 유모세포의 재생에 대한 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
REFERENCES
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