Telomerase Activity in Oral Leukoplakia Tissues.

Tae, Kyung; Ahn, Myung Ju; Lee, Hyung Seok; Park, Bum Jung; Ahn, Kyung Sung

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery > Volume 42(1); 1999 > Article

Original Article

Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 1999;42(1): 82-87.

Telomerase Activity in Oral Leukoplakia Tissues.

Kyung Tae, Myung Ju Ahn, Hyung Seok Lee, Bum Jung Park, Kyung Sung Ahn

¹Department of Otolaryngology, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea. kytae@email.hanyang.ac.kr
²Department of Internal Medicine, College of Medicine, Hanyang University, Seoul, Korea.

구강백반증조직의 Telomerase 활성도

태 경¹ · 안명주² · 이형석¹ · 박범정¹ · 안경성¹

한양대학교 의과대학 이비인후과학교실1;내과학교실2;

주제어: 구강백반증ㆍ구강암ㆍTelomerase.

ABSTRACT

BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Telomeres are specialized structures found at the ends of eukaryotic chromosomes. Telomeres stabilize the chromosome and protect DNA from illegitimate recombination. Telomerase is a ribonucleoprotein, a RNA dependent DNA polymerase, and acts as a reverse transcriptase-like enzyme, which maintains telomere length by adding telomeric repeat units of TTAGGG to the telomeric end. These telomeric repeat units have been found only in cells with unlimited replicative potential such as sperm cells, immortalized cell lines and cancer tissues, but not in normal somatic cells. Telomerase is believed to be characteristic of and may be the best indicator of cell immortality. This study was performed to indentify the role of telomerase activity in the multistep carcinogenesis of oral squamous cell carcinoma.
MATERIALS AND METHODS:
We performed a telomeric repeat amplification protocol assay in 10 oral leukoplakia, 5 tongue cancers and 10 normal oral mucosa tissues.
RESULTS:
All the five tongue cancer tissues showed telomerase activity. Although telomerase activity was detected in 9 of 10 oral leukoplakia tissues and in 9 of 10 normal oral mucosa tissues, the activity of telomerase was low compared to that of cancer tissues by semiquantitative analysis.
CONCLUSION:
These findings suggest that telomerase maybe play a key role in multistep carcinogenesis of oral malignancy. Telomerase activity was detectable in normal oral mucosa with renewal activity suggested that this enzyme might be an indicator of cell proliferation.

Keywords: Oral leukoplakiaㆍOral cancerㆍTelomerase

서론 인간의 염색체 말단에는 telomere라는 특수구조가 있는데 TTAGGG가 대략 수백에서 30 kb 정도되는 tandem DNA repeat와 단백질로 되어 있다.1) Telomere는 다른 염색체와의 비정상적인 결합을 방지하여 염색체를 보호하고 매 세포분열시 마다 염색체의 끝이 떨어져 나가는 end replication problem을 해결하는 중요한 기능을 가지고 있다. 일반적으로 세포가 분열할 때마다 telomere로부터 약 50에서 200개의 nucleotide가 소실되어 짧아지는데2) telomere의 단축은 세포분열에서 mitotic clock으로 작용하여 telomere가 어느 길이 이상 짧아지면 정상 체세포에서는 더 이상 세포분열이 일어나지 않게 된다.3) 그러나 배선세포(germ line cell)나 태아세포(fetal cell)에서는 telomere의 길이가 유지되어 계속 분열을 하게 된다. Telomerase는 ribonucleoprotein으로 reverse transcriptase와 비슷한 작용을 하는 RNA dependent DNA polymerase이다. Telomerase는 자신의 RNA를 형판으로 하여 telomeric DNA를 만들어 telomere의 길이를 유지시킨다.4) 사람의 정소나 난소의 배세포, 불멸화세포주(immortalized cell line), 또는 대부분의 암세포에서는 telomerase 활성도가 계속 유지되어 telomere가 복원되어 세포분열이 계속 일어나지만 완전히 분화된 체세포나 노화세포에서는 telomerase 활성도가 없어서 더 이상의 세포분열이 일어나지 않는다고 한다.5)6) 최근 혈액암, 신경모세포종, 위암, 폐암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 대장암, 전립선암, 유방암조직을 비롯한 대부분의 암조직이나 암세포주에서 telomerase의 활성도가 있는 것으로 밝혀졌으며7-11) telomerase의 활성은 암세포의 불멸화(immortalization)와 연관이 있는 것으로 생각되어진다. Telomerase의 활성화는 암조직에 따라 활성화되는 시기가 다른 것으로 알려져 있는데 대장암과 췌장암에서는 암발생단계의 후기에 활성화되며 유방암, 두경부암, 간암이나 생쥐의 피부암에서는 전구암단계에서 활성화되는 것으로 알려져 있다.10) 대부분의 암세포에서 telomerase 활성도가 있는 반면 암주위의 정상세포에서는 telomerase의 활성도가 없는 것으로 미루어 telomerase의 지속적인 발현이 telomere를 유지시킴으로서 정상세포에서 암세포로의 형질변환에 관련이 있을 것으로 추정되고 있다. 그러나 telomerase의 활성화가 암발생의 필수조건인지 아니면 암발생과 동반되는 현상인지는 아직 확실히 밝혀져 있지 않다. 또한 암발생과 관련하여 어느 단계에서 telomerase의 활성화가 일어나는지는 아직 확실하지 않다. 두경부암의 암발생 과정은 다단계 발암기전으로 설명되고 있으며 이는 정상 상피세포에서 전구암 단계를 거쳐 암세포로 발전하며 각 단계마다 여러 유전적인 변화가 축적되는 것으로 알려져 있다. 구강백반증은 임상적으로 하얀 구강점막소견을 보이는 병변으로 여기에는 상피세포의 과각화증, 과증식, 이형성증을 포함하고 있다. 구강백반증은 두경부암의 다단계 발생설을 연구하는데 좋은 모델이 되며 이 병변에서 암이 발생하는 확율은 0∼20% 정도로 알려져 있다.9) 이에 저자들은 설암과 전구암 병변인 구강 백반증 및 정상 구강점막에서 TRAP(telomeric repeat amplification protocol) 방법을12) 이용하여 telomerase의 활성화를 측정하여 두경부암의 다단계 암발생과정에서의 telomerase의 역할을 알아보고자 하였다. 대상 및 방법 대상 연구대상은 한양대학교병원 이비인후과에서 구강백반증으로 조직검사를 시행받은 10명의 환자를 대상으로 하였으며 조직검사시 얻은 조직은 바로 -70℃에 동결보존하였다가 실험에 사용하였다. 정상 대조조직은 같은 환자의 정상부위의 구강점막을 얻거나 타질환으로 구강부위를 수술받는 환자의 정상 구강점막부위의 조직을 얻었으며 10례를 대상으로 하였다. 5례의 설암조직에서 telomerase의 활성도를 측정하여 전구암과 암조직에서의 활성도를 비교하고자 하였다. 10례의 구강백반증의 발생부위는 협부점막이 1례, 혀의 측면이 9례였으며 조직병리학적 양상은 8례가 과각화증이였으며 1례가 과증식, 1례에서 이형성증이 있었다(Table 1). 방법 조직 추출액 -70℃에 보관하던 구강백반증조직, 구강암조직 및 정상 구강점막조직으로부터 20에서 50 mg의 절취한 조직을 10 mM Hepes-KOH(pH 7.5), 1.5 mM MgCl 2, 10 mM KCl, 1mM dithiolthreitol(DTT)로 구성된 ice cold wash buffer로 세척하였다. 조직에 10 mM tris-HCl(pH 7.5), 1 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, 0.1 mM phenylmethylsulfonylfluoride(PMSF), 5mM β-mercaptoethanol, 0.5% CHAPS, 10% glycerol로 구성된 lysis buffer 40에서 100 μl를 혼합하여 Kontes 튜브에 넣고 450 rpm의 속도로 조직을 균질화 하였다. 균질화된 조직은 4℃에서 25분간 incubation한 다음 10,000×g로 20분간 원심분리시켜 상층부위의 조직추출액을 얻었다. 양성대조군으로 NB4 세포주(acute promyelocytic leukemia cell line)를 이용하였으며 ice-cold phosphate buffered saline(PBS)과 ice-cold wash buffer로 두 번 씻은 다음 4℃에서 5분간 3,000×g로 원심분리하여 얻은 pellet에서 같은 방법으로 추출액을 얻었다. 음성대조군으로는 조직추출액 대신 물을 사용하였으며 조직추출액에 RNase를 첨가하여 band가 없어지는 것을 확인하였다. TRAP assay를 이용한 telomere의 증폭 Eppendorf tube에 0.1 μg의 CX primer(5'-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3')를 넣고 그 위에 wax를 놓아 상층반응액과 분리시켰다. Wax 상층부위에는 20 mM tris-HCl(pH8.3), 1.5 mM MgCl 2, 63 mM KCl, 0.005% Tween-20, 1 mM EGTA, 2U Taq polymerase, 50 μM dNTP, 0.1 μg TS primer(5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3') 및 6 μl의 CHAPS 조직추출액을 넣어 혼합하였다. 이는 telomerase에 의해 telomeric repeat가 생성되고 CX primer와 TS primer에 의해 양 방향으로 PCR(polymerase chain reaction)이 되도록 하기 위한 것이며 tube 중간의 wax는 먼저 상층부에서 telomeric DNA가 만들어지고 wax가 녹은 다음 CX primer가 섞여 PCR 반응이 일어나도록 하기 위한 것이다. 그리고 Taq polymerase inhibitor의 존재 여부를 알아보고자 internal telomerase ampification standard(ITAS) primer를 각 반응에 포함시켰다. 실온에서 약 30분간 연장(extension)반응을 시킨후 튜브를 DNA thermal cycler(Robocycler 40；Stratagene, La Jolla, CA)로 옮겨서 94℃에서 30초, 50℃에서 30초, 72℃에서 45초의 반응조건으로 35 cycle PCR 반응을 시켰다. PCR반응물중 20 μl를 취하여 15% polyacrylamide non-denaturating gel에서 1×tris-borate EDTA(TBE)를 완충액으로 전기영동한 다음 silver stain으로 염색하여 사다리 모양의 telomere repeat를 관찰하였다. Telomerase 활성도의 반정량적인 비교 검사를 위해 조직추출액을 10배 및 100배 희석하여 비교 실험하였으며 이때 10배와 100배 희석된 조직추출액에는 각각 0.6 μg과 0.06 μg의 단백질이 들어있게 된다. 결과 10례의 구강백반증 조직 중 9례(90%)에서 telomerase 활성도가 관찰되었으며 이형성증이 있었던 1례에서는 과각화증이 있었던 경우 보다 상대적으로 약간 강한 활성도를 나타내었다(Fig. 1). 10례의 정상 구강점막조직 중 9례(90%)에서 telomerase 활성화가 관찰되었다(Fig. 2). 5례의 구강암 조직에서는 5례 모두에서 telomerase 활성도를 나타내었다(Fig. 3). 구강암조직에서의 telomerase 활성도가 상대적으로 정상 구강점막조직이나 구강백반증조직 보다는 강하였으며 이의 반정량적인 비교를 위해 10배, 100배 희석하여 검사한 결과 정상 구강점막조직과 구강백반증조직에서는 10배 희석한 경우에서 telomerase의 활성도가 나타나지 않았으나 구강암조직에서는 10배 희석에서도 활성도가 있었다(Fig. 4). 고찰 두경부암이 발생하기 위해서는 세포의 성장, 분화와 증식에 관련된 여러 유전인자의 변이가 축적되어야 하며 여기에는 여러 종양발현유전자(oncogene), 종양억제유전자(tumor suppressor gene), 성장인자(growth factor) 및 변형된 성장인자 수용체 등이 관련이 있는 것으로 추측되고 있다. 최근에 telomere와 telomerase에 대한 연구가 진행됨에 따라 이 telomerase의 지속적인 발현이 암세포에서 telomere의 길이를 유지시킴으로써 암세포가 무한증식 능력을 갖게 되는 것과 관련이 있을 것으로 추정되고 있다.5)6)12) 암세포의 불멸화는 telomerase의 발현에 관련된 유전인자의 돌연변이에 의해 야기되며 이로서 telomerase가 재활성화되어 암세포가 계속 증식하게 되나 이 telomerase의 활성화가 암을 유발하는데 필수적인 요소인지는 아직 확실하지 않다. Murnane 등13)이 불멸화된 섬유모세포에서 telomerase의 활성화를 관찰할 수 없었다고 보고한 것으로 미루어 세포의 불멸화과정은 telomerase에 의한 것 이외에 다른 기전이 있지 않나 추정되고 있다. 그러나 이 다른 불멸화기전이 인간의 암세포에서도 존재하는 지는 아직 확실하지 않다. Telomere의 tandem repeat의 수는 telomere 단축과 연장의 균형에 의해 결정되는데 많은 유전적, 생리학적인 요소가 telomere 길이에 영향을 미친다. 인간의 배세포주(germ cell line)는 평균 10 kb의 telomeric TTAGGG repeat를 가지며 telomere 길이를 연령이나 배양된 세포의 분열수에 따라 분석해보면 연령이나 세포분열의 수가 증가할수록 telomere의 길이가 점차 감소한다.14) 즉 telomere의 길이가 어느 이상으로 짧아지면 세포노후를 뜻하며 telomere의 길이 유지가 세포가 무한정으로 증식하기 위해서 필요하며 이를 위해 telomerase의 활성화가 반드시 필요하다.2)15) 이러한 telomerase의 활성도를 간접적으로 terminal restriction fragment(TRF) 방법으로 telomere의 길이를 측정하여 알 수 있으나 Kim등12)은 여러 불멸화 세포주(immortalized cell line)의 TRF 길이를 측정한 결과 TRF의 길이와 telomerase 활성도가 꼭 일치하지는 않는다고 하였다. 종전에 telomerase의 활성도는 in vitro에서 primer extension assay에 의해 측정하였으며 telomerase의 추출방법도 세포의 저장성 팽창(hypotonic swelling) 및 물리적 파괴(physical disruption)를 이용하였으나 이 방법은 검사의 민감도가 떨어져 적어도 10 7∼10 8개의 세포가 필요하며 세포의 종류에 따라 추출효율의 변화가 많았다.5) 그러나 최근에 개발된 PCR을 이용하는 TRAP방법은 세포에서 telomerase 단백질을 추출하는 방법도 향상되었으며 검사의 민감도가 높아 약 50개 정도의 telomerase 활성도가 있는 세포만 있어도 측정이 가능하여 세침흡인된 검체나 구강이나 대장, 폐에서의 세척액, 소변, 뇌척수액, 복수 등의 검체에서도 telomerase의 측정이 가능하게 되었다.10)16) 저자들은 TRAP 방법에 의해 10례의 구강 백반증조직, 10례의 정상 구강점막조직과 5례의 구강암조직에서 telomerase의 활성도를 측정한 결과 구강백반증조직은 10례중 9례(90%), 구강암은 5례중 전례(100%)에서 telomerase의 활성도가 있었다. 뿐만 아니라 정상 구강점막조직의 10례 중 9례(90%)에서도 telomerase의 활성도가 검출되었다. 정상 구강점막조직에서의 telomerase 활성도에 관한 다른 연구들에서 서로 다른 상반되는 결과들이 보고되었는데 Mao 등8)은 두경부암조직의 93%에서 telomerase의 활성화가 있었으나 암 주변의 정상조직에서는 telomerase의 활성화가 없고 암 주변조직중 이형성증(dysplasia)과 과증식(hyperplasia) 등이 있었던 경우에서는 telomerase의 활성화가 있었다 하였다. Mutirangura 등9)은 두경부암의 16례 중 14례(87.5%)에서 telomerase의 활성화가 있었으며 구강 백반증조직 및 홍색비유증(erythroplasia)에서는 26례 중 10례(38.5%)에서 활성도가 있었고 구강백반증이나 구강암 주위의 정상 구강점막은 18례중 1례를 제외하고는 활성도가 없었다 하였다. 그리고 구강백반증 조직중 이형성증이 심할수록 telomerase 활성도가 상대적으로 높았다 하였다. 그러나 Kannan 등17)은 구강암과 구강백반증의 75%에서 telomerase 활성도가 있었고 정상 구강점막조직도 7례 중 6례에서 telomerase 활성도가 있었다 하였다. 구강백반증조직은 다수에서 점막하에 염증세포의 침윤이 있으며 활성화된 림프구에서는 telomerase의 활성도가 존재할 수 있기 때문에 실험의 판정에 주의를 기울여야 된다.8)10) 그러나 림프절이나 비장(spleen)에서는 telomerase의 활성도가 관찰되지 않고 저자들의 검체에서 염증이 없었던 경우의 대부분에서 telomerase의 활성화가 관찰되었기 때문에 림프구에 의한 영향은 아닌 것으로 생각된다. 또한 telomerase의 실험에 대한 판정에서 또 하나 주의하여야 할 것이 중합효소반응 억제제가 검체에 존재할 가능성인데 저자들의 경우 이 억제제에 대한 internal control probe를 넣어 실험하였기 때문에 이에 대한 오차는 없는 것으로 생각된다. 지금까지 일반적으로 암세포에서는 telomerase의 활성도가 있고 체세포에서는 telomerase의 활성도가 없는 것으로 알려져 왔으나 최근 표피의 기저세포(basal cell of epidermis), 장의 소낭선세포(intestine crypt cell), 림프구 등과 같이 증식이 빠른 renewal tissues에서는 telomerase의 활성화가 관찰되는데 이는 세포분열이 빠르기 때문에 급속히 telomere가 짧아지는 것을 방지하기 위한 것으로 사료된다.10) Ramirez 등18)은 인간의 모낭(hair follicle)에서 telomerase의 활성도를 측정하였는데 증식이 빠른 anagen follicle에서는 telomerase의 활성도가 관찰되었으나 catagen follicle에서는 telomerase의 활성도가 없다고 하였다. Kyo등19)은 인간의 자궁내막(uterine endometrium)에서 telomerase의 활성도를 측정하였는데 proliferative phase 에서는 95%에서 telomerase의 활성도가 관찰되었고 secretory phase에서는 42%에서 telomerase의 활성도가 있었으며 proliferative phase에서 secretory phase에 비해 상대적으로 강한 활성도를 나타내었고 telomerase 활성도는 PCNA로 증식지표를 측정한 결과 자궁내막의 증식도와 강한 연관관계가 있었다 하였다. Tatematsu 등20)은 정상인의 말초혈액 및 골수세포와, 만성 골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia), 급성 골수성 백혈병(acute myelogenous leukemia) 환자로부터 telomerase의 활성도를 측정하였는데 정상인에서는 약한 telomerase 활성도가 있었으며 만성 골수성 백혈병의 chonic phase에서는 telomerase의 활성도가 없었고 blastic crisis때 강한 telomerase 활성도를 나타내며 대부분의 급성골수성 백혈병환자에서는 활성도가 있었다 하였다. 저자들의 경우 정상 구강점막에서도 telomerase의 활성화가 관찰되었는데 이는 Ramierz 등,18) Kyo 등19)의 연구결과 및 조혈모세포 등과 같이 증식이 빠른 renewal tissues에서는 telomerase의 활성도가 있었던 것처럼 구강점막도 증식이 빠르기 때문에 telomerase의 활성도가 나타난 것으로 생각되며 구강점막상피 세포의 turnover가 빠르고 증식이 계속 일어나게 되는 것은 기저층에 간세포(stem cell)가 많기 때문인 것으로 알려져 있다.17) 또한 구강상피 기저층의 간세포(stem cell)는 조혈모세포와 비슷한 증식형태를 갖는 것으로 세포증식 실험에서 밝혀졌다.17) 위의 결과로 미루어 telomerase의 활성도는 암세포에 특이적인 현상이 아니라 세포의 증식지수와 더 연관이 있지 않나 사료된다. 또한 저자들의 경우 구강백반증의 90%에서 telomerase의 활성화가 관찰되었는데 이는 Mao등8), Mutirangura 등9)의 결과와 일치하며 세포의 이형성이 심할수록 활성도가 높은 것으로 미루어 구강암의 다단계 발암과정에 telomerase의 활성화가 관련될 것으로 생각된다. 결론 결론적으로 본 연구의 결과로 미루어 telomerase 활성화가 두경부암의 다단계 발암과정과 관련이 있을 것으로 생각된다. 그러나 정상 구강점막에서도 telomerase의 활성도가 검출되는 것으로 미루어 보면 telomerase의 활성화가 암발생의 필수조건은 아니며 세포분열이 빠른 조직에서는 telomerase 활성화가 있을 수 있으며 telomerase 활성화는 세포증식을 나타내는 지표로서 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
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