| The Effect of Antidiuretic Hormone on Ionic Currents of Strial Marginal Cells in Neonate Rate. |
| Jun Ho Lee, Sang Jeong Kim, Jun Kim, Ki Whan Kim |
1Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Seoul National University, College of Medicine, Seoul, Korea. kimkw@plaza.snu.ac.kr
2Department of Physiology and Biophysics, Seoul National University, College of Medicine, Seoul, Korea. |
| 신생쥐 와우 변연세포에서의 항이뇨호르몬의 효과 |
| 이준호1,2 · 김상정2 · 김 전2 · 김기환2 |
| 서울대학교 의과대학 이비인후과학교실1;생리과학교실2; |
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| 주제어:
막전압고정법ㆍ변연세포ㆍ항이뇨호르몬ㆍ내이. |
| ABSTRACT |
BACKGROUND AND OBJECTIVES:
Strial marginal cells are known to secrete K(+) into endolymph. Slowly activating, voltagede-pendent K(+) channels (I(sK) channels) have been identified in the apical membrane of these cells. Although antidiuretic hormone (vasopressin) has been known to play an important role in the various tissues, its physiological and phamacological roles in the inner ear are still unknown. The purpose of this study is to to investigate the hypothesis that vasopressin increases apical K(+) secretion.
MATERIALS AND METHODS:
On-cell macro-patch recordings were made on the apical membrane of strial marginal cells dissected from neonate rat. The effect of vasopressin was compared to the one of raising the bath K(+) concentration.
RESULTS:
We observed I(sK) channels in 21 patches (9%) of 235 high resistance seals. When the pipette contained NaCl-pipette solution, raising the bath K(+) concentration from 3.6 mM to 25 mM led to a statistically significant increase in apical outward K(+) current from 0.44+/-0.04 pA to 3.31+/-0.40 pA (n=10). When the bath K(+) concentration was returned to 3.6 mM, the outward current declined to 0.45+/-0.04 pA, which was not statistically different from the original level. Arginine vasopressin (AVP, 10-7 M) increased apical current from 0.43+/-0.04 pA to 2.20+/-0.30 pA (n=10). The current stimulated by elevated AVP was carried by the apical I(sK) channel.
CONCLUSION:
Our results demonstrate that AVP receptor is present in marginal cells and that AVP increases transepithelial K(+) secretion by activation of I(sK) channel in neonate rat. |
| Keywords:
Patch-clampㆍMarginal cellㆍVasopressinㆍInner ear |
서론
내림프액은 150 mM 이상의 높은 K＋농도를 유지하고 있어 신체 내 다른 기관과는 구별되는 세포외 환경을 유지하고 있다. 이러한 높은 K＋농도는 혈관조(stria vascularis) 변연세포(marginal cell)에서의 K＋ 분비에 의해 유지된다.1) 혈관조 변연세포의 apical membrane에는 nonselective cation, maxi K, Cl channel2)과 Isk/KvLQT1 channel(I sK channel)3) 등이 존재함이 알려져 있다. 수초에 걸쳐 활성화되고, 막전압 의존성 K＋통로(slowly activating voltage-dependent K＋-selective channel)의 특성을 가지고 있는 I sK channel을 통해서 내림프액의 높은 K＋ 농도는 유지된다.3)4)
혈관조의 변연세포와 전정 암세포(vestibular dark cell)사이에는 형태학적, 기능적 유사성이 있으며, 이들 세포에서 외림프 K＋ 농도의 증가,1) 저삼투압 용액,5) 세포내 혹은 세포외 pH 산성화6) 등에 의해 K＋의 분비가 증가된다.
호르몬에 대한 효과는 일부가 알려져 있으며, β-adrenergic agonist가 basolateral side에 작용시켰을 때 K＋의 분비를 증가7)시켰으며, 세포막 투과성의 cAMP도 K＋의 분비를 증가시킨다는 보고가 있었다.8)
급성 스트레스 상황에서 혈액에 다량의 항이뇨호르몬9)과 catecholamine10)이 검출되었고, 메니에르병 환자들의 혈청 항이뇨호르몬의 농도가 유의하게 증가된 것으로 보고되어,11) 항이뇨호르몬은 메니에르병의 발병에 어떤 역할을 하리라 제시되어 왔다. 동물실험에서는, 외림프액에 항이뇨호르몬을 관주했을 때, 용량 의존적이고 가역적으로 내림프전압이 감소하며, 항이뇨호르몬의 수용체 아형인 V1 수용체에 대한 길항약으로는 이 반응을 감소시킬 수 없었던 반면, V2 수용체에 대한 작동약은 내림프전압을 감소시켰다는 보고가 있다.12) Julien 등13)은 항이뇨호르몬이 선천적으로 결핍된 Brattleboro 쥐에서 항이뇨호르몬을 처치하면 내림프내의 정상적 K＋ gradient가 회복됨을 보고하면서, 항이뇨호르몬이 수분투과성 증대와 K＋의 분비에 관여할 것이라 하였다. 반면에, Wangemann 등7)은 micro-Ussing 실험에서 항이뇨호르몬을 성숙들쥐의 혈관조 변연세포에 처치했을 때 대조군과 비교하였을 때 차이가 없었다고 보고하였다. Furuta 등14)은 in situ hybridization연구에서 신생쥐의 내이 전반에 걸쳐 항이뇨호르몬 수용체 아형인 V 1a와 V2 수용체가 존재한다 하였지만, 성숙 흰쥐에서는 이런 수용체들이 표현되지 않았다고 보고하였다.
이러한 연구결과들로 미루어 보아 항이뇨호르몬이 내이에서 어떤 역할을 하리라 생각되지만, 아직까지는 구체적인 역할이 무엇이며 그 직접적인 증거는 제시된 바 없다. 본 연구는 신생쥐 혈관조 변연세포의 apical membrane에서의 on-cell recording을 통하여 첫째, I sK channel을 확인하고, 둘째, bath에 K＋ 농도를 증가시킬 때 K＋ 분비가 증가된다15)고 보고된 결과를 확인하고, 세째, 항이뇨호르몬이 변연세포에 작용하는지, 작용한다면 어떤 반응을 보이는 지 알아보고자 하였다.
방법 및 재료
실험조직의 준비
생후 3일에서 9일된 신생쥐의 두경부를 절제하고 그 측두골을 얻어, 4℃의 외림프액과 비슷한 이온조성을 가진 표준 용액속에서 해부하여 와우를 얻었다. 와우를 싸고 있는 골을 수술현미경하에서 미세겸자를 이용하여 막미로가 손상받지 않도록 주의하여 제거하였다. 막미로를 기저부부터 와우축에서 분리한 후 기저막과 Reissner's membrane을 제거하여 막미로의 측벽을 얻었다.
세포막 전류의 기록
막미로의 측벽을 표준용액이 담겨있는 약 2 ml 크기의 기록챔버로 옮기고, 미세겸자를 이용하여 혈관조를 나선인대(spiral ligament)로부터 분리하였다. 변연세포층이 위쪽으로 향하게 위치시키고, 관류액에 조직이 움직이지 않도록 고정시켰다. 기록챔버를 현미경으로 옮겨 특징적인 다각형 모양의 혈관조 변연세포를 확인하였다(Fig. 1).
세포막 전류의 기록은 on-cell macro-patch recording을 이용하였다. pipette 전극은 two stage vertical puller(Na-rishige)를 이용하여 만들고, 끝 지름은 1.5∼2.0 μm가 되도록 하였다. 전극의 저항은 pipette용액으로 채웠을 때 표준용액속에서 2.2∼2.8 ml이었다. reference 전극은 Ag-AgCl전극을 사용하였다. 측정은 high resistance seal(2-6 Gl)을 얻은 후 하였다. 안정전위를 모르기 때문에 -V P는 patched membrane에서의 전압차 변화를 표현하고자 하였다. 막전압고정과 세포막 전류의 측정과 기록 및 분석을 위하여 EPC-9 patch clamp amplifier와 Pulse-Pulsefit 8.09(HEKA electronics, FRG)를 사용하였다. 수침(water immersion)렌즈를 사용하는 직립현미경하에서 vi-sual patch를 시행하였다. 모든 실험은 32℃에서 실시하였고, 전류의 측정은 한 조직으로 3시간내에 측정하였다.
시약 및 용액
NaCl-pipette 용액으로는 NaCl 150, KCl 3.6, MgCl2 1.0, CaCl2 0.7, HEPES 10 mM이 각각 사용되었다. 세포외 관류용액으로는 NaCl 150, K 2HPO4 1.6, KH 2PO4 0.4, MgCl2 1, CaCl2 0.7, glucose 5 mM이 표준 관류용액으로 사용되었다. 표준 관류용액에서 NaCl 150 mM을 Na-Cl 128.6, KCl 21.4 mM로 바꾼 용액이 25K 관류용액으로 사용되었다. 모든 용액은 32℃에서 pH 7.4에 적정하였다. 항이뇨 호르몬인 [Arg 8]vasopressin(AVP)은 RBI(USA)에서 구입하였다.
통계처리
데이터는 평균±표준편차로 나타내었고, n은 관찰수이다. 통계분석으로는 paired t-test를 사용하여 p<0.05값을 유의수준으로 판정하였다.
결과
혈관조 변연세포 apical membrane에서의 I sK channel
235개의 high resistance seal중에서 서서히 활성화되는 막전압 의존성 외향전류를 관찰한 경우는 21개(9%)였다(Fig. 2). 유지전압 0 mV에서 -60 mV에서 ＋60 mV까지 20 mV간격으로 각각 3초간 step voltage를 주었을 때, 탈분극 전압인 ＋60 mV에서는 수 초에 결쳐 서서히 증가하는 외향성 이온전류인 I sK current를 보였다. 활성화 시간상수(activation time constant)는 0 mV에서 ＋60 mV의 전압변화에서 1247±157 msec였다(n＝5). ＋60 mV 탈분극에 의한 활성화는 3초 동안에는 최고치에 도달하지 않고 계속 증가하였다.
관류용액의 K ＋ 농도 증가에 대한 변연세포의 반응
NaCl-pipette 용액으로 on-cell recording 상태에서 표준 관류용액을 25K 관류용액으로 바꾸어 주었을 때 외향 K ＋ 전류가 증가하였다(Fig. 3A). voltage protocol은 Marcus 등이 사용한 방법15)을 사용하였다. 즉, 유지전압 0 mV에서 ±10 mV의 변화를 각각 500 ms동안 주고 이 과정을 5초마다 반복하였다(Fig. 3B). 데이터는 ±10 mV의 변화후 유지전압이 0 mV인 2초동안의 전압값을 평균한 값으로 정하였다. 3.6 mM에서 25 mM로 K ＋ 농도를 올렸을 때, 외향전류는 0.44±0.04 pA에서 3.31±0.40 pA로 증가하여 유의한 차이를 보였다(n＝10). 표준 관류용액으로 바꾸었을 때는 감소하기 시작하여 최초의 값과 통계학적으로 유의한 차이가 없는 0.45 ± 0.04 pA로 감소하였다(n＝10).
Fig. 4는 25K 관류용액으로 바꾸어 주었을 때 step voltage에서 나타나는 변화를 기록한 것이다. 표준 관류용액일 때 탈분극 전압에서 I sK current의 활성도가 적은 반면, 25K 관류용액으로 바꾸고 나서 3분이 경과하면 그 활성도가 더욱 커짐을 관찰할 수 있었고, 다시 표준 관류용액으로 바꾼후 3분이 지나면 처음의 활성도로 돌아감을 알 수 있었다(n＝5). 활성도가 최고치에 도달했을 때 현미경을 통해 세포를 관찰하면 세포의 부피가 증가해 있음을 확인할 수 있었다.
변연세포에서 항이뇨 호르몬의 효과
Fig. 5는 NaCl-pipette 용액으로 on-cell recording 상태에서, 10 -7 M의 AVP를 흘려주었을 때 변연세포 apical membrane에서 외향전류가 증가함을 보여준다. Voltage protocol은 Fig. 3B와 같다. 표준 관류용액에서의 외향전류인 0.43±0.04 pA에서 2.20±0.30 pA만큼 증가하였다(n＝10). 이런 외향전류의 증가는 wash-out 5분후에도 감소하지 않았다.
AVP를 흘려주었을 때 step voltage상에서의 변화를 보면(Fig. 6), 탈분극 전압에서 활성화되는 외향전류가 없다가 AVP로 바꾼 후 2분, 4분이 되면서 활성화되는 I sK current가 나타남을 알 수 있었다(n＝5).
고찰
내이조직에서 visual patch
변연세포는 basolateral membrane과 apical membrane에서 이온통로의 종류와 역할이 다른 분비성 상피세포의 특성을 보이기 때문에, 분리세포나 배양세포로는 변연세포 고유의 특성이 유지될 수 없다고 보는 것이 일반적인 견해이다. 조직자체를 기록쳄버에 올려놓고 도립현미경으로 보면 다른 세포층에 가려 제일 위층에 있는 변연세포를 관찰할 수가 없다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 다른 보고1)3)4)8)에서는 변연세포를 바깥쪽으로 향하게 한 상태로 loop모양으로 감아 가장자리부분에서 변연세포를 관찰하고 전극을 접근시킨 것으로 생각된다. 본 연구에서 사용된 현미경은 brain slice patch clamp 실험에서 사용되고 있는 직립현미경으로서, 세개의 세포층으로 되어있는 혈관조에서 제일 위쪽에 있는 변연세포를 정확히 확인할 수 있다(Fig. 1). visual patch의 의미는 brain slice에서 직립현미경에 있는 수침렌즈를 사용하면 조직에 있는 신경세포를 확인, 접근시킬수 있다는 점에서 붙여진 명칭이다. visual patch를 이용함에 따른 장점은 첫째, 조직을 loop로 감아야 하는 어려운 과정을 반복할 필요가 없으며, 둘째, loop로 감았을 때 세포에 가해지는 긴장도는 실제 생체에서의 구조와 반대되는데, 이런 점이 실험에 미칠 수 어떤 영향을 최대한 배제할 수 있으며, 세째, 혈관조 변연세포 주변의 내이 세포, 즉 Claudius cell, 지지세포, 유모세포, Reissner's memb-rane 등이 정확히 구별되기 때문에, 세포를 분리하지 않고 조직 자체를 가지고 변연세포 이외의 세포에서도 patch clamp를 할 수 있는점 등이다. 단점으로는 위쪽에서 접근하는 대물렌즈 때문에 전극의 접근각도가 도립현미경에서보다 적어서 giga ohm seal에 도달할 확률이 적다는 점이다. 따라서 전극끝의 크기를 더 크게 만들 수는 없다는 점이 macroscopic current를 측정해야 하는 본 실험에서의 제한점이라고 생각된다.
조직의 준비
혈관조 변연세포에서의 patch clamp는 나선인대가 붙어있는 상태로 할 수 있지만, 본 연구에서 나선인대로부터 혈관조를 분리해내는 이유는 호르몬의 수용체가 혈관이 분포해 있는 basolateral membrane에 존재하리라 생각되기 때문이다. 분리과정에서 혈관조 기저세포층이 일부 파손되면, 호르몬의 변연세포 basolateral membrane에로의 접근이 용이하리라는 생각이다. 실제로 Wangemann 등1)은 ouabain과 bumetanide의 효과가 나선인대가 있는 상태에서는 6∼8분 사이에 생기는 데, 나선인대를 제거한 상태에서는 2.5-3분 사이에 나타난다 하였다.
변연세포 apical membrane에서 I sK channel
본 연구에서 보여준 slowly-activating outward current는 다음과 같은 이유로 I sK channel이라 할 수 있다. 첫째, 탈분극 전압에서 서서히 수초에 걸쳐 활성화되는 이온전류는 특징적이어서 I sK channel이라 할 수 있으며, I sK를 표현하는 여러 조직에서 관찰된 것과 동일하다. 둘째, 활성화 시간상수가 Xenopus oocytes의 I sK channel에서 관찰된 것16)과 유사하다. 이러한 I sK channel은 내이의 변연세포, 전정암세포, 심장근세포에서만 내인성 발현되어 있는 것으로 알려져 있으며, K ＋-selective한 통로로 증명된 바 있다.4)
본 연구에서는 I sK channel을 step voltage에서 관찰하기 힘든 경우가 많았다. Sunose 등은 성숙기니피그에서 639개의 high resistance seal중에 24%에서 single channel activity를 관찰했고, 17%에서는 하나 이상의 channel을 관찰했다고 보고하였다.3) Shen 등의 보고에 의하면 fluctuation analysis에 의해 구한 I sK channel의 single channel conductance는 1.6 pS으로 알려지고 있어,4) Sunose 등이 보고한 single channel activity는 하나 이상의 channel activity일 것으로 생각된다. 따라서 본 연구에서 single channel activity를 기록, 분간한다는 것은 noise level 때문에 힘들었던 것으로 생각되었다. 본 실험에서 9%에서만이 slowly activating, voltage-dependent I sK channel을 관찰할 수 있었는데 만약 종간의 차이가 크지 않다면, 이것은 Sunose 등의 실험에서 보여진 총41%보다 크게 적은 수치이다. 이러한 결과는 신생쥐 변연세포 apical membrane의 I sK channel의 밀도가 성숙쥐에 비교하여 적을 수 있음을 시사하며, 신생시기에는 I sK channel이 발생되고 있는 단계에 있음을 시사한다.
K＋ 농도증가에 대한 변연세포의 반응
표준 관류용액을 25K 관류용액으로 바꾸어 주었을 때 전정암세포의 용적이 증가하며, 이것은 관류용액에 Na＋과 Cl-가 동시에 존재할 때에 생기며, Na＋/2Cl-/K＋ cotranespo-rter inhibitor인 piretanide에 의해 억제된다고 보고된 바 있다.17) Marcus 등은 전정암세포의 cell-attached macro-patch 실험에서, 25K 관류용액으로 바꾸어 주었을 때 외향 K＋ 전류가 증가함과 Na＋/2Cl-/K＋ cotransporter inhi-bitor인 bumetanide에 의해 이러한 K＋ 전류가 억제됨을 보여주었다.15) 종합하면, 외향 K＋ 전류의 증가는 basolate-ral membrane의 Na＋, K＋-ATPase, Na＋/2Cl-/K＋ cot-ransporter에 의해 K＋이 흡수되어 apical membrane에서 I sK channel을 통해 분비되는 것으로 알려져 있다. 그러나, 고농도의 K＋ 용액에 의한 탈분극이 외향 K＋ 전류에 얼마나 기여할 지는 알 수 없다.
항이뇨호르몬의 효과와 생리학적인 역활
본 연구에서 항이뇨호르몬이 신생쥐 혈관조 변연세포에서 I sK channel 활성화를 통해 K＋ 분비를 증가시키는 역할을 함을 보여준다. cAMP가 K＋ 분비를 증가시킨다는 보고8)에서 유추해 볼 때 항이뇨호르몬의 이차전령은 cAMP일 가능성이 있다. 이러한 I sK channel의 활성화에 관한 세포기전은 두가지 방법을 통해서 일어날 수 있다 하였다. 첫째, cAMP 혹은 cAMP-dependent protein kinase(PKA)가 I sK channel을 활성화시키는 경우이다. I sK protein에는 PKA에 의한 phosphorylation이 일어날 수 있는 consensus se-quence가 없지만, KvLQT1 subunit에는 몇 개의 장소가 있는 것으로 알려져있다.18) 둘째, I sK channel수를 조절시켜주는 membrane traffic pathway에 영향을 미치는 경우이다.
생리학적인 역할에 대해서는 여러 실험 결과를 토대로 추론해 볼 수 있다. Furuta 등14)은 성숙쥐에서는 V 1a, V2 수용체의 발현이 없고, 생후 0일된 신생쥐 조직에서는 내이 전체조직에서 발현이 되며, 생후 8일된 조직에서는 V 1a 수용체는 혈관조와 Claudius cell에서만 발현되며, V2 수용체는 정상보다 약간 감소해 있는 것을 보고하였다. 또한, Wangemann 등7)은 성숙저빌에서 AVP가 반응이 없음을 보고한 바 있다. Akino 등19)은 생후 0일에서부터 서서히 증가하기 시작한 내림프의 K＋ 농도가 생후 8일이 되면 정점에 다다르며, 이때부터 내림프전압이 급격히 증가하는 것을 보고한 바 있다. 이러한 보고들을 본 연구의 결과와 함께 추론해보면, 항이뇨호르몬이 신생시기에는 내림프의 이온조성을 완성시켜 주는 생리학적인 역할을 수행하지만, 성숙시기에는 항이뇨호르몬 수용체가 down-regulation되어 있을 가능성을 시사한다.
결론
신생쥐 변연세포의 apical membrane에서 on-cell macro-patch을 이용하여 I sK channel을 확인하였다. 관류용액의 K＋ 농도가 증가하면 K＋ 분비가 증가하는 보고를 확인하고, 이 K＋전류는 I sK channel을 통함을 알 수 있었다. 항이뇨호르몬은 변연세포에 작용하여 I sK channel을 활성화시키며, K＋ 분비를 증가시킨다.
REFERENCES
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