교신저자：조재식, 501-757 광주광역시 동구 학1동 8 전남대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   비강과 부비동의 악성종양은 전신에 발생하는 다른 악성종양에 비하여 아주 드물게 발생하며 특히 상악암은 증상이 부비동염과 비슷하고 비특이적이며 어느정도 병변이 진행한 후에 발견되므로 예후가 불량한 경우가 많다.¹⁾
   발병원인으로는 니켈, 크롬, 가죽 등에 노출된 경우에 발생한다는 직업적인 요인과 환경적 요인, 바이러스 감염 등 다양한 원인들이 제시되고 있으며, 만성부비동염이 상악암과 밀접한 연관관계가 있다는 연구도 보고되고 있다.²⁾ 분자생물학이 발달함에 따라 인형유두종바이러스(human papillomavi rus, 이하 HPV로 칭함)나 Epstein-Barr virus(EBV) 등에 대한 연구들이 많이 이루어지면서 1983년 Syrjanen 등이 비강내 발생한 반전성유두종의 원인인자로 HPV를 처음으로 기술하였고³⁾ 상악암에서는 1992년에 Furuta 등이 비강과 부비동의 편평세포암종에서 HPV 제 16 형과 제 18 형을 검출하여 그 연관성에 대하여 언급하였다.⁴⁾ HPV는 보고자에 따라 두경부종양에서는 15~50% 정도에서 HPV DNA가 발견된다고 한다.⁵⁾ EBV는 HPV와 같은 epitheli otropic virus로서 두경부 호흡상피조직에 감염되기 때문에 비인강암, 후두암, 이하선암 등과 관계있는 것으로 알려져 왔다. 상악암에서 이들 바이러스에 대한 보고는 드물지만 HPV는 주로 반전성 유두종과 연관하여 4~75%로 다양하게 발현율이 보고되었으며,⁶⁾⁷⁾ EBV는 Lopategui 등의 연구에 의하면 아시아계에 발생한 부비동의 미분화암의 11예중 7예에서 양성으로 검출한 보고가 있다.⁸⁾ 이처럼 상악암의 발병원인인자로서 HPV와 EBV에 대한 관련성은 몇몇 연구자들에 의해 제한적으로 보고되었을 따름이므로 저자들은 상악암으로 진단된 환자들에서 HPV와 EBV DNA를 PCR을 이용하여 검출함으로써 그 원인인자로서의 역할과 T병기, 림프절 전이유무, 국소재발 등 임상적인 의의와의 상관관계에 대하여 알아보고자 하였다.

대상 및 방법

대  상
   1988년부터 1999년까지 전남대학교병원에 내원한 환자로서 상악동에 발생하여 병리조직학적으로 상악암으로 진단된 증례중 파라핀포매괴의 상태가 비교적 양호한 40예를 대상으로 하였다. 조직학적으로는 편평세포암종 34예, 선암종 5예, 선양낭성암종 1예였으며, 성별분포는 전체 40예중 남자 29예, 여자 11예로 남녀비는 약 3：1이었고, 연령분포는 31세에서 79세까지로 50대에 호발하였으며 평균연령은 56.7세였다.
   대조군으로는 염증성 용종으로 진단된 10예 환자의 비종양조직을 포르말린으로 고정한 파라핀포매괴를 이용하였다.

방  법

중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction：PCR)에 의한 HPV와 EBV의 검출

DNA 검출
   대상검체는 포르말린 고정후 파라핀포매로된 생검조직 혹은 수술조직으로 보관중인 것을 사용하였다. 미세 박편절편기를 이용하여 10 μm두께로 10~15조각씩 잘라서 1.5 mL eppendorff tube에 담고 xylene 1 mL를 첨가한후 상온에서 10분정도 shaker에서 혼합하고서 10,000 rpm에서 3분정도 원심분리기로 분리한 후에 100% ethanol 0.5 mL를 섞어 다시 3분정도 원심분리하는 탈파라핀과정을 2~3회 거친 후에 acetone을 이용하여 세척하고 건조시켰다. 이후에 DNA를 추출하기 위하여 100μg proteinase K(Kodak)와 1 mL DNAzol(MRC)을 이용하여 하룻 밤을 방치시킨 후에 13,000 rpm에서 10분가량 원심분리후에 부유물(super natant)에 100% ethanol 0.5 mL를 넣고 상온에서 3분정도 보관후에 DNA를 추출하였다.

Polymerase chain reaction 과정
   PCR에 의한 유전자 증폭은 멸균소독된 0.5 mL eppen dorf tube에 50 μL의 반응물(10X PCR 완충액, 200 μM dNTP, 2 unit의 Taq DNA polymerase, 12.5 pM each primer, 1.5 mM MgCl₂, 증류수 및 template DNA)을 만들고, 이 반응물을 Perklin Elmer GeneAmp PCR system 9600을 이용하여 95°C에서 5분동안 초기 변성화과정을 거치고나서, denaturation(94°C, 1분), annealing(55°C, 1분) 및 extension(72°C, 1분)의 과정을 35회 반복후 4°C로 보관되도록 하였다.
   사용한 primer로서 HPV 검출에는 Manos 등이 사용한 HPV consensus primers MY09 and MY11을 이용하였으며, 아형검출에는 제 16 형과 제 18 형의 HPV DNA primer(한국생공)을 이용하였고, EBV는 Macdonald가 사용했던 gene sequence를 이용하여 primer를 제작하였다(Table 1).
   대조군으로는 양성대조군으로 HPV는 HPV DNA가 확인된 자궁 경부암조직을 이용하였으며, EBV는 EBV DNA가 확인된 비인강암조직을 이용하였다. 비종양대조군으로는 염증성 비용종으로 진단된 환자의 조직을 이용하였다.

판  독
   PCR반응물 일부(12 uL)를 취하여 1.9% agarose gel상에서 100 volt로 40분간 전기영동한후 0.5 μg/mL ethidium bromide 용액에 5~10분 동안 염색하고 자외선하에서 DNA 증폭산물을 확인한 다음 Polaroid 카메라로 촬영하였다. DNA Size marker로는 φX174 RF/Hae III를 이용하였다.

결     과

   HPV consensus primer를 이용하여 PCR을 수행한후 총 5예에서 450-bp의 HPV 유전자형의 band를 확인하였고(Fig. 1), HPV-16아형을 검출하기위하여 oligoprimer을 이용한 PCR을 시행한 결과 HPV consensus primer에 양성을 보였던 5예중 3예에서 239-bp HPV 16형 유전자형의 band를 확인하였으며(Fig. 2), HPV 18형은 검출되지 않았고, EBV는 모든 조직에서 음성반응을 나타내었다(Figs. 3 and 4). 또한 상악암조직이 아닌 염증성 용종의 대조군에서는 HPV와 EBV가 모두 음성반응을 보였다.
   상악암에서 HPV는 총 40예중에서 5예(12.5%)에서 양성으로 나타났으며, 조직학적으로는 편평세포암종 34예중에서만 모두 양성(14.7%)을 나타냈고 선암종과 선양낭성암종에서는 음성을 나타내었으며, 아형검사에서는 5예중 3예에서 HPV-16에 양성반응을 보였으나 2예는 아형을 구분하는데 실패하였다. 반면 EBV는 1예에서도 검출되지 않았다(Table 2).
   또한 HPV가 발견된 5예중에서 상악암의 병기를 나타내는 T3 병기가 2예, T4 병기가 3예였으며, 2예에서는 림프절의 전이가 있었고, 5예에서는 국소재발이 발생되었다(Table 3). 하지만 HPV의 존재유무와 이러한 임상양상들간의 의미있는 상관관계는 발견할 수 없었다(p>0.05, Chi-Square test).

고     찰

   구미의 통계에 의하면 비강과 부비동에 발생하는 악성종양은 전신에 발생하는 악성종양의 약 0.2~0.8%를 차지하며, 상부기관식도 부위에 발생하는 악성종양의 약 3%를 차지한다고 한다.¹⁾ 그 중에서 상악동(60%)에 주로 발생하고 그외 비강(20%)과 사골동(15%)에 발생하며 접형동과 전두동이나 비전정(5%)은 매우 드문 것으로 알려져 있다.¹⁾ 상악암은 유럽이나 미국보다는 일본이나 아프리카에서 더 많이 발생하고, 미국의 경우 200,000명에 1명꼴로 발생하여 연간 약 1,250여명의 발병율을 보인다고 한다.²⁾ 발생원인은 아직 정확히 밝혀지지 않았지만 상악암은 특히 직업적인 환경노출과 많은 연관이 있는 것으로 알려져 있다. Nickel worker의 경우 10~20년간 근무하면 약 870배의 발병율이 증가하며 기타 wood worker, mustard gas, isopropyl alcohol, thorium 등과 만성부비동염, 바이러스 감염 등과 연관이 있다는 보고들이 있다.²⁾
   최근 분자생물학의 발전으로 조직내 바이러스를 검출하는 많은 방법들이 개발되면서 상악암이나 상부 기관식도부위종양에서도 병인으로 HPV나 Epstein-Barr virus(EBV) 등을 검출하려는 연구들이 다양하게 진행되고 있다.
   1983년 Syrjanen 등이 비강내 발생한 반전성 유두종에서 원인인자로 HPV를 처음으로 기술하였고,³⁾ 이후 두경부영역에서 발생한 편평세포암종에서도 HPV에 대한 많은 연구들이 진행되었다. Abramson 등은 southern bolt hybridization을 이용하여 후두의 우상암종(verrucous carcinoma)에서 HPV 16을 최초로 검출하였다.⁹⁾ Brandsma와 Abramson은 두경부종양에서 101명의 편평세포암종환자군과 대조군으로 116명의 정상인에서 HPV16를 southern blot hybridization을 이용하여 연구하였는데 설암과 편도, 후두에 발생한 편평세포암종에서 약 13~29%의 양성률이 있다고 발표하기도 하였다.¹⁰⁾ 이후 Kiyabu 등은 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 후두와 구강점막, 혀에 발생한 편평세포암종에서 각각 40%, 38%, 29%의 HPV16 DNA를 검출하였고,¹¹⁾ Hoshikawa 등도 34명의 경부전이를 갖는 후두암 환자를 대상으로 PCR을 이용하여 17.6%의 HPV16 DNA를 검출하여 보고하였다.¹²⁾
   하지만 아직까지도 비강과 부비동에 발생한 편평세포암종 등에 있어 HPV에 대한 연구는 미미한 상태다. Syrjanen 등이 in situ hybridization(ISH)를 이용하여 비강과 부비동에 발생한 편평세포암종과 반전성유두종에서 HPV16을 검출하였고,¹³⁾ Ishibashi 등이 상악암에서 southern blot hybridization을 이용하여 HPV16 DNA를 검출하였다.¹⁴⁾ 1992년 Furuta 등은 PCR을 이용하여 비강과 부비동에서 편평세포암종으로 진단된 40예의 환자들의 파라핀을 이용하여 고정된 조직으로 HPV16과 HPV18을 각각 12%, 2%검출하여, 비강과 부비동의 편평세포암종과 HPV의 상관관계에 대한 관련성에 대하여 최초로 언급하기도 하였다.⁴⁾ 같은 해 Kashima 등도 부비동에 발생한 24예의 편평세포암종에서 1예에서 HPV18 DNA를 역시 PCR을 이용하여 검출하였고⁶⁾ 1997년 Caruana 등은 부비동의 반전성유두종에서 HPV의 감염이 있을 때 편평세포암종의 발생율이 증가함을 발표하였다.⁷⁾
   HPV는 약 8000개의 염기를 갖는 DNA virus로서 현재까지 약 65여종의 아형이 발견되었고 30종 이상이 피부질환 또는 점막의 이상과 관련이 있는 것으로 보고되었으며 보고자에 따라 두경부종양에서는 15~50% 정도에서 HPV DNA가 발견된다고 하였는데⁵⁾ 본 연구에서도 12.5%의 양성률을 보였다. HPV는 아형에 따라 구분하는데 16형, 18형, 31형과 33형 등은 악성조직과 전암단계에서 검출되기 때문에 고위험군으로 분류하며,¹⁵⁾ 6형과 11형은 악성종양보다는 양성종양에 관여하는 저위험군으로 분류하기도 한다.¹⁶⁾ 본 연구에서도 HPV-16형이 3예에서 양성소견을 보였는데 이것은 악성조직에서 검출된 것으로 의의있는 소견으로 생각할 수 있겠다.
   EBV는 herpesvirus에 속하는 이중쇄(double-stranded) DNA virus로서 150~180 nm 크기이고, 175K 염기쌍으로 구성되어 있으며, HPV와 같은 epitheliotropic virus로서 두경부 호흡상피조직에 감염되어 비인강암, 후두암, 이하선암 등과 관계있는 것으로 알려져 왔다. 비강과 부비동에서는 처음 McDonald 등에 의하여 비강내 발생한 반전성 유두종에서 PCR을 이용하여 20예중 13예(65%)를 검출하여 그 연관가능성을 제시하였고,¹⁷⁾ Gallo 등은 13예의 부비동암에서 in situ hybridization을 이용하여 5예(38%)에서 EBV DNA를 검출하여 병인으로서의 가능성을 언급하였으며,¹⁸⁾ Leung 역시 29예의 부비동암중 7예에서 EBV를 검출하여 암의 유발인자로 가능성을 제시하였다.¹⁹⁾ 그러나 Gaffey 등은 PCR을 이용하여 20예의 반전성 유두종에서 2예를 검출하였으나 ISH를 이용할 경우에는 단지 1예의 일부 stromal lymphocyte에서만 양성을 보이고 종양 component에서는 음성을 보여 연관성이 없다고 보고하기도 하여 아직 많은 논란이 되고 있다.²⁰⁾ 저자들의 경우 40예 전부에서 음성소견을 보였지만 병인으로서의 연관성을 알기위해서는 EBV RNA 등 더욱 민감한 검사 등이 추가로 필요할 것으로 사료된다.
   조직내에서 바이러스를 검출하는 방법으로는 광학현미경이나 전자현미경을 이용하는 방법, 면역조직화학염색법, so uthern blot hybridization, in situ hybridization(ISH), polymerase chain reaction(PCR) 등의 방법이 있다. 초기에 HPV를 검출하는 방법으로 많이 이용된 southern blot hybridization은 비교적 많은 양의 신선조직편이 필요하고 번거로울 뿐만 아니라 예민도도 낮은 것으로 알려져 있다. 이후 in situ hybridization이 개발되어 파라핀포매괴에 고정되어 있는 조직에서 HPV DNA가 존재하는 위치까지도 알 수 있는 방법으로 선호되었으나 예민도가 떨어지는 단점이 있어 최근에는 예민도가 높은 PCR이 개발되어 많은 연구에서 이용되고 있다. PCR은 신선한 조직뿐만 아니라 파라핀에 고정된 조직에서도 병원체의 유전자를 쉽게 검출해 낼 수 있다. 그러나 PCR은 예민도가 높은 점에 비하여 검출된 병원체의 유전자의 위치는 알 수 없는 단점이 있다.
   본 연구에서는 PCR을 이용하여 총 40예의 상악암중 5예(12.5%)에서 HPV DNA가 양성소견을 보이고 EBV의 경우 모두 음성소견을 보였는데 상악암에서 이러한 연구들이 아직 다양하게 진행되지 않아 비교하기는 곤란하지만 Fu ruta가 PCR을 이용하여 실험한 12%와 비슷한 결과였다. EBV의 경우도 마찬가지로 아직 상악암에서 아직 병인으로 많은 논란이 되고 있는 상태로 저자들의 경우 모두 음성소견을 보여 일단은 병인으로서는 무관한 것으로 생각되어지지만 더 많은 연구가 필요할것으로 생각된다. HPV의 아형을 2예에서 밝히지 못하였는데 저자들은 처음 HPV consensus primer을 이용하여 HPV DNA를 검출하였고, 이에 양성을 보인 5예를 이용하여 아형구분을 위해 HPV16과 HPV18 primer를 사용하여 3예에서 HPV16을 검출하였으나 2예는 음성소견을 보였다. 그래서 다른 아형의 primer가 있는 실험실에 의뢰하여 HPV11/13/31/33/35를 추가로 검사하였지만 역시 음성소견을 보여 아형검출에는 실패하였다. 이는 다른 아형의 존재가능성도 생각할 수 있으나 더 이상의 아형을 모두 실험할 수는 없어 더 이상 검사는 하지 못하였다.

결     론

   총 40예의 상악암 환자군중 5예(12.5%)에서 HPV consensus primer에 양성을 보였으며, 그 중 3예에서 HPV-16 아형 검사결과 양성이었으며 2예는 아형을 구분하지 못하였다. EBV는 1예에서도 양성으로 나타나지 않았고, 비종양대조군으로 사용한 염증성용종군에서도 모두 음성을 나타냈다.
   이상의 결과로 HPV는 상악암 원인인자로서 가능하다는 것을 알 수 있었고, EBV는 검출되지 않았지만 EBV RNA 등 추가적인 검사가 필요할 것으로 생각된다. 또한 본 연구에서는 HPV 양성군이나 음성군간에 있어서 임상적인 의의나 차이는 발견할 수 없었다.

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