교신저자：이병주, 602-739 부산광역시 서구 아미동 1가 10번지  부산대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   하인두암은 조기 진단이 힘들고 경부림프절로의 전이가 빈발하여 매우 진행된 경우에 진단되는 경우가 많다. 또한 수술시 후두를 포함하는 광범위한 절제가 필요하여 많은 기능적 손상을 초래하는 예후가 나쁜 악성종양이다. 이러한 하인두암의 치료로 항암화학요법, 수술, 방사선 치료 등을 시행하나 5년 생존율은 20~30%정도인 것으로 알려져 있다.¹⁾ 
   하인두암의 치료로 수술 후 방사선 치료가 가장 기본적인 치료로 인정되고 있으나 수술의 위험성과 수술 후 필연적으로 초래되는 음성장애와 연하장애 등의 기능적 장애가 문제시되고 있다. 항암화학요법 후 방사선 치료를 순차적으로 시행하거나 동시에 시행하는 치료법은 수술후에 나타나는 기능적 손상이 없어 최근에 많이 사용되고 있다.¹⁾²⁾ 
   하인두암의 항암화학요법에 주로 사용되는 약제는 cisplatin과 5-fluorouracil(5-FU)이다. Cisplatin과 5-FU의 병합 요법은 하인두암과 비인강암을 포함하는 두경부 악성종양에 주로 사용된다.³⁾⁴⁾ Cisplatin은 DNA 사슬의 crosslinking을 초래하여 DNA 구조의 변화와 비정상적인 염기짝을 형성하여 암세포에 작용한다. 5-FU는 DNA 합성에 중요한 효소인 thymidylate synthase(TS)를 억제하여 암세포에 작용한다.⁵⁾ 
   하인두암을 비롯한 두경부암에서 cisplatin을 단독 사용하는 경우에는 반응률은 20~30%로 보고되고 있고, 5-FU를 단독으로 사용하는 경우에는 15%로 보고되고 있다.⁵⁾⁶⁾⁷⁾ Cisplatin과 5-FU를 병용하여 사용하는 경우 반응률은 40% 내외로 알려져 있다. 이러한 반응률의 차이의 원인으로는 원발암의 위치, 암세포의 분화 정도, 종양의 크기, 병의 진행정도, 전신적인 영양 및 건강 상태, p53 돌연변이 유무, 암세포내에서 DNA의 양, 항암제의 작용기전 등 여러 가지 요소가 있다.⁸⁾⁹⁾ 하인두암을 비롯한 두경부암에서 이러한 반응성의 차이에 대한 분자생물학적인 설명은 아직 미미하다.
   세포에 손상을 주는 방사선 조사, 여러 가지 항암제에 의한 세포고사는 p53-의존경로(p53-dependent pathway)와 p53-비의존경로(p53-independent pathway)가 있다. 방사선 조사나 항암제에 의한 세포정지 또한 p21-의존경로(p21-dependent pathway)와 p21-비의존경로(p21-indepentent pathway)가 있다. 이러한 것은 항암제의 종류, 세포주의 상태, 원발암의 종류, p53 돌연변이 유무 등 여러 가지 인자에 따라 차이가 있는 것으로 되어 있다.
   본 연구에서는 mutant p53(one point mutation of 78th base, C to G, in exon 7)을 가지고 있는 하인두암세포주 PNUH-12¹⁰⁾에서 cisplatin 과 5-FU를 처리시 p53 단백질의 변화를 관찰하고, p53 단백질의 변화와 약물에 따른 세포의 반응의 차이를 알아보고자 하였다.

방     법

세포배양

사용 시약과 기기
   세포배양을 위해 DMEM, fetal bovine serum(FBS), 0.05% trypsin-0.02% EDTA 그리고 100units/ml penicillin-streptomycin(GIBCO Co., New York, USA)를 사용하였다. 세포배양은 CO₂ 배양기(NAPCO：6101-1)를 사용하였다.

세포주

암세포
   부산대학교병원 이비인후과학 교실에서 확립한 하인두 편평상피암에서 유래한 PNUH-12를 이용하였다.¹⁰⁾ 

세포 배양
   PNUH-12는 100units/ml의 penicilin-streptomycin과 10%의 FBS가 함유된 DMEM을 사용하여 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배양된 암세포는 일주일에 2~3회 배지를 교환하고 6~7일 만에 PBS로 세척한 후 0.05% trypsin-0.02% EDTA로 부착된 세포를 분리하여 원심분리한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 6~7일 마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다.

세포독성 검사
배양된 암세포를 96 well plate에 well당 1.8×10⁴ cells/well이 되도록 심고 하루동안 배양 후, cisplatin과 5-FU를 농도별로 첨가한 다음, 37°C, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 24시간, 48시간 후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 100 μl를 첨가하고 4시간 동안 더 배양한 후 생성된 formazan 결정을 DMSO에 녹여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

Western blot
   배양된 PNUH-12 세포에 아무것도 처리하지 않은 대조군과 cisplatin과 5-FU를 처리한 후 24시간 배양하고 lysis buffer를 첨가 4°C에서 10분동안 반응시킨다. 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 분리하였다. 단백질(150ul)을 5×sample loading buffer와 함께, SDS-polyacrylamide gel 전기영동한 후 15 V로 30분간 gel에 있는 단백질 밴드를 nitro cellulose membrane(Amersham Corp.)에 옮겼다. 그 후, nitro cellulose membrane을 5% nonfat dry milk가 첨가된 TNT buffer(0.5% Tween-20, 100 mM Tris-cl pH 7.6 1.5M NaCl) 액에 1시간 담궈 비특이적인 반응을 정지시켰다. 1차 항원 p53(On-cogene, Ab-2)을 500배 희석하여 1시간동안 반응시켰다. TNT buffer로 10분씩 흔들면서 5회 세척한 후, 1000배 희석한 2차 항원[Anti-mouse IgG, peroxidase-linked species-specific whole antibody(from sheep NA931 ECL^TM )]를 1시간 반응시켰다. 다시 TNT buffer로 10분씩 흔들면서 5회 세척한 후, supersignal chemiluminescent substrate(Pierce)를 사용하여 반응시킨 다음, radiographic film에 노출시켰다. 같은 방법으로 항원 p21 (Bioscience, 610234)에 대한 western blotting을 시행하였다.

Propidium iodide(PI) staining
   배양된 PNUH-12 세포를 1×10⁶/ml로 심고 하루동안 배양 후 약물을 처리한 배지에서 48시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS로 씻고 70% ethanol로 5분간 고정한 후, PI(propidium iodide Sigma, USA)로 염색하여 형광현미경 하에서 관찰하였다.

DNA electrophoresis
   배양된 PNUH-12 세포에 1×10⁶ cell/ml로 seeding하고 아무것도 처리하지 않은 대조군과 시료를 농도별로 처리한 후 48시간 배양하고 lysis buffer를 처리하였다. 4°C에서 30분간 정치하고 4°C에서 10분간 12,000 rpm에서 원심분리하여 상등액을 모은 후, 50°C에서 4시간 동안 protenage K(Gibco, Co. BRL)를 처리하였다. Phenol extraction 방법으로 DNA를 분리하고 5.0M NaCl과 100% isopropanol을 첨가하여 잘 섞은 다음 -70°C에서 1시간 방치하고 12,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 pellet을 증류수에 녹여 2% agarose gel에서 1×TAE buffer로 3~4시간(50 V) 전기영동하여 ethidium bromide로 염색하고 UV transilluminator하에서 DNA 단편화 현상을 관찰하였다.

DNA flow cytometry
   PNUH-12를 1×10⁵/ml이 되도록 심고 하루동안 배양한 후 약물을 처리한 배지에서 48시간동안 배양된 세포를 PBS용액으로 수세한다. CycleTest^TM PLUS DNA Reagent Kit(Becton Dickinson. San Jose. CA)을 이용하여 DNA염색 후 FACSort flow cytometer(Becton Dickinson. San Jose. CA)를 이용하여 세포주기를 비교 분석하였다.

결     과

세포독성 검사
   Cisplatin 처리의 농도와 노출 시간이 증가할수록 세포 생존율은 감소하였다. 48시간 노출시 IC₅₀은 3 μM이었다. 5-FU처리시 역시 노출 농도와 노출 시간이 증가할수록 cell survival은 감소하였다. 48시간 노출시 IC₅₀은 30 μM이었다(Fig. 1).

p53 단백과 p21 단백
   Cisplatin(3 μM, 12hr)과 5-FU(30 μM, 12hr)를 처리하였을 경우 모두에서 p53 단백질은 증가하였다. 5-FU 처리시에는 p21 단백질의 증가가 관찰되었으나 cisplatin 처리시에는 p21 단백질의 증가는 관찰되지 않았다(Fig. 2).

세포고사
   Cisplatin을 48시간, 8 μM을 처리한 경우에 DNA electrophoresis와 PI stain 방법으로 세포고사를 확인할 수 있었다(Figs. 3 and 4). 그러나 5-FU를 처리한 경우에는 노출 농도와 시간을 48시간, 320 μM까지 증가시켜도 세포고사를 확인할 수가 없었다.

세포주기의 변화
   Cisplatin(3 μM, 24hr)을 처리하는 경우 S-phase가 14.2%에서 48.7%로 증가하였다. 그러나 5-FU(30 μM, 24hr)를 처리한 경우에는 G1 phase가 64.4%에서 74.3%로 증가하였다(Fig. 5).

고     찰

   암 세포는 성장을 조절할 수 없는 계속적으로 증식하는 것을 특징으로 한다. 세포는 정상적인 프로그램된 세포의 죽음(programmed cell death), 즉 세포고사(apoptosis)와는 관계없이 계속 증식하여 암의 발생과 성장에 중요한 역할을 한다. 이러한 것에 관계되는 중요한 유전자중의 하나가 p53 유전자이다. 하인두암을 포함한 두경부 계통의 암에서도 p53 종양억제유전자의 변이가 있고, 본 연구에 사용된 하인두암 세포주 PNUH-12는 p53에 one point mutation이 있다. 즉 PNUH-12는 mutant p53와 wide type p53이 모두 존재하고 이러한 chimeric complex는 negative dominant effect에 의해 정상적인 유전자의 발현을 억제하여 암이 발생한다고 알려져 있다.¹¹⁾ 
   정상적인 p53 단백질(wide type p53)은 세포의 성장과 분화에 관여하는 기능을 가지고 있으며, 세포내 DNA가 손상을 받으면 손상된 DNA를 복구하거나 세포고사를 유도한다. 그러나 이러한 유전자에 이상이 있으면 p53의 기능이 손상되어 암세포의 증식이 일어난다. p53 유전자는 세포고사, 세포 증식, 세포 정지 등에 관여함으로써 발암 기전에 중요한 역할을 담당한다.
   이러한 p53의 기능은 p53 단백질에 의해 조절되는 다른 유전자의 발현을 유도하거나 억제함으로써 그 기능을 수행한다. 이러한 유전자로는 p53의 기능을 negative regulation하는 MDM2, 세포주기에 조절에 관여하는 p21 WAF/CIP, cyclin G, 손상된 DNA의 복구에 관련되는 GADD45, 세포증식과 관련되는 IGF-BP3, 세포고사와 연관되는 BAX, 그리고 angiogenesis를 억제하는 TSP-1 등이 있다.¹¹⁾ 
   p53의 여러 가지 기능 중 항암제 또는 방사선 조사 등과 같은 DNA에 손상을 주는 경우에 2가지의 반응이 있다고 알려져 있다. DNA에 대한 손상이 적을 경우에는 p53이 발현되어 세포 정지와 손상된 DNA를 복구하는 방향으로 진행된다. 그러나 DNA의 손상이 너무 심하고 회복할 수 없을 정도일 경우에는 발현된 p53이 손상된 세포를 세포 고사로 진행시킨다는 것이다.¹²⁾ DNA의 손상의 정도와 p53은 밀접한 관계가 있다.
   정상적인 기능을 수행할 수 없는 mutant p53이 있는 경우에는 여러 가지 항암제에 대한 반응이 다를 수 있다. Koechli 등¹³⁾은 유방암에서 mutant p53 단백의 농도와 항암제의 반응성에 대한 연구에서 mutant p53 단백의 양이 증가할수록 항암제에 대해 저항성이 있고 암이 재발하는 경향이 있다고 하였다. 또한 미국 암 연구소는 유방암, 폐암, 대장암, 신장암, 난소암, 신경암, 백혈병, 전립선암, 흑색종 등 58개의 세포주를 대상으로 한 연구에서 항암제와 방사선에 의한 반응성은 항암제의 종류와 세포주의 p53 돌연변이와 연관성이 있다고 하였다.⁹⁾ 그러나 Zamble 등¹⁴⁾은 쥐의 고환암세포에서 cisplatin에 의한 항암효과의 민감성은 p53의 mutation과는 연관성이 없다고 하였다. Mirjolet 등¹⁵⁾은 암세포주 연구에서 p53의 mutation은 5-FU에 의한 항암효과의 민감성에는 관계가 없고, Bcl-2/Bax의 protein ratio가 관련이 있다고 하였다. Patel 등¹⁶⁾은 두경부암 특히 구강암 세포주에서 p53와 Bcl-2의 상태는 방사선 조사나 bleomycin의 처리에 대한 반응 차이에 영향이 없다고 하였다. 그러므로 항암제 처리시 p53의 돌연변이와 세포에 대한 항암작용의 민감성에 대해 아직 논란이 있다.
   항암제와 방사선에 의해 세포에 손상을 주는 기전으로 p53-dependent pathway와 p53-independent pathway가 있다. PNUH-12에서는 cisplatin과 5-FU 처리시 p53 단백질이 증가하여, 이러한 약제에 의한 세포의 항암 작용은 p53-dependent pathway로 진행되는 것을 알 수 있었다.
   PNUH-12에 cisplatin를 처리하였을 때 p53 단백질의 발현이 증가하였으나 p21 단백질 증가 없이 세포고사로 진행되었고, flow cytometry상 S기가 증가하였다. 이러한 소견은 p53 dependent apoptosis일 경우에는 p21 단백질의 발현이 없다는 보고와 일치한다.¹⁷⁾ 그러나 Siddik 등¹⁸⁾은 p53에 돌연변이가 있는 난소암 세포주 2780CP에서 cisplatin을 처리하였을 때 p53 단백질과 p21 단백질의 변화가 없고, 방사선 조사시 p53 단백질이 증가하였다는 보고와는 약간의 차이가 있다. Zamble 등¹⁴⁾은 p53에 돌연변이가 있는 쥐의 고환암의 세포주에 cisplatin을 처리하였을때 p53의 mRNA의 발현없이 p21 단백질이 증가하였고, cisplatin을 고농도로 처리시 G1/early S 세포주기에 성장정지가 있다고 보고하여 p21의 발현이 p53과 무관하다고 하였다. 또한 Wang 등⁴⁾은 비인강암에서 cisplatin에 의해 세포고사가 관찰되지 않고 단지 노화와 유사한 G2/M기의 성작억제가 관찰된다고 하였지만 PNUH-12에서는 cispla-tin에 의해 세포고사와 S기 증가가 관찰되었다. Cispla-tin에 대한 세포주의 반응은 p53의 돌연변이에 따라 다를 수 있지만 같은 돌연변이가 있어도 세포주의 특징과 원발암의 위치 등 여러 가지 요소에 따라 다른 반응을 보이는 것을 알 수 있다.
   5-FU을 처리한 경우에는 p53 단백질의 증가와 같이 p21 단백질도 증가하였고, G1 세포주기 정지는 관찰되었지만 세포고사는 관찰되지 않았다. 그러나 Yoneda 등¹⁹⁾은 구강암 세포주에서 5-FU를 처리한 경우 p53 단백질과 p21 단백질의 변화는 없었지만 세포고사가 인지되어 p53과 p21에 비의존적인 세포고사와 세포정지가 있다고 하여 본 연구와는 차이가 있었다.
   p53 단백질의 증가에 의해서도 세포정지로 진행될 수도 있고 세포고사로 진행될 수 있다. 이러한 것을 결정하는 인자는 세포 손상의 정도라고 알려져 있다. 즉 DNA에 대한 손상이 작을 경우에는 p53 단백질의 발현이 적고 이러한 p53 단백질의 작용은 세포 정지와 손상된 DNA를 복구하는 방향으로 진행된다. 그러나 DNA의 손상이 너무 심하고 회복할 수 없을 정도의 손상일 경우에는 발현된 p53 단백질의 발현이 증가되고 이 손상된 세포를 세포 고사로 진행시킨다는 것이다.¹²⁾ 그 외에도 이러한 세포 반응에 영향을 주는 인자로는 세포의 종류, 세포고사나 세포정지를 유발하는 자극의 종류, p53에 의해 조절되는 유전자의 발현 종류와 정도 등이 있다.²⁰⁾ 하인두암 세포주 PNUH-12에서 cisplatin과 5-FU를 처리하였을 경우 모두에서 p53 단백질의 증가되었지만 cisplatin에 의해 세포고사가 유도되고, 5-FU에 의해 세포정지가 유도되었다. 이러한 차이는 p53 단백질의 발현정도에 의한 차이는 아니며, 항암제의 작용기전 차이와 p53 단백질에 의해 조절되는 여러 가지 다른 유전자의 발현 차이에 의한 것으로 생각된다.
   세포고사를 유도하는 cisplatin이 세포정지를 유도하는 5-FU보다 항암작용에서 더욱 효과적일 것으로 생각된다. 이러한 결과는 실제로 임상에서 cisplatin이 5-FU에 비해 하인두암을 비롯한 두경부암에서 더 효과적인 것을 설명할 수 있을 것으로 생각된다.

결     론

   하인두암 세포주 PNUH-12에서 cisplatin와 5-FU 처리시 모두에서 p53이 증가하였으나 cisplatin에서는 세포고사가 발생하였고, 5-FU 처리시는 p21 단백의 증가와 G1기 세포정지가 발생하였다.

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