교신저자：황의기, 431-070 경기도 안양시 동안구 평촌동 896번지  청담서울이비인후과
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서     론

   암 예방은 발암성 물질(carcinogenic agents)을 제거하거나 전암성 병변을 감지하고 제거하는데 있으나 근래에는 전암성 병변(premalignant lesion)에서 발암현상(carcinogenesis)을 역전하는 암예방화학이 새로운 연구분야이다. 암예방화학은 약물을 이용하여 발암현상의 과정을 억제하거나 역전함으로써 암을 예방하는 것이다. 임상 전 실험에서 많은 종류의 약물이 암 전환을 억제하는 잠재력을 갖고 있으나 레티노이드가 기본약물이고 연구가 가장 많이 되어 있다. 
   레티노이드를 실제 임상에서 사용하여 여러 종류의 암에 있어 효과가 있다는 보고가 많다. 구강의 전암성 병변인 구강 백반(oral leukoplakia)에서 all-trans-retinoic acid (RA)를 경구로 투여하여 45% 정도에서 완전 또는 부분 관해를 관찰하였고 13-cis-RA가 포함된 연고를 11예의 구강 백반에 도포하여 9예에서 효과를 보았다는 보고가 있다.¹⁾²⁾
   두경부 편평세포암종 환자의 조직 및 편평세포암종 세포에서 prostaglandin, 특히 PGE₂가 가장 많이 검출되었다는 연구결과로 보아 PGE₂가 편평세포암종에서 주요 역할을 하리라 생각된다.³⁾⁴⁾⁵⁾ Fidler-Nagy 등⁶⁾은 쥐의 복막 대식세포(macrophage)와 사람의 피부 섬유모세포(fibroblast)에 레티노이드를 투여하여 PGE₂ 생성이 현저히 감소되는 것을 관찰하였고 ElAttar 등⁷⁾은 사람의 구강 편평세포암종 세포에 레티노이드를 투여하여 PGE₂가 억제되었다고 보고 하였다.
   레티노이드는 발암성 작용물질에 노출된 세포에서 암 형성을 억제한다고 알려져 있는데 암예방효과를 일으키는 기전에 대해서는 아직 확실하게 알지 못하고 있는 실정이다. 
   본 연구의 목적은 부작용이 적어 발암 억제제로 유망한 합성 레티노이드인 N-4-HPR을 편평세포암종 세포주에 투여한 후 PGE₂ 생성 억제 기전을 확인하고자 N-4-HPR이 prostaglandin 생성하는 유발 효소인 cyclooxygenase의 활성, 특히 Cox-2 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는가를 알기 위한 것이다. 

재료 및 방법

세포배양
   두경부 편평세포암종 세포로서 MDA 886Ln을 사용하였다. 세포들은 약 10% fetal bovine serum과 gentamycin(50 ug/ml)이 추가된 DME-F12 medium에 48시간 동안 단층 배양(monolayer culture)하였다. 

MDA 886Ln 편평세포암종 세포의 PGE₂ 생성에 대한 네 종류 레티노이드의 효과 
   배양된 6-well plate에서 대조군은 0.01% DMSO가 포함된 2 ml medium으로 교체하였고 4개의 군에 각각 1μM의 all-trans-RA, 13-cis-RA, retinyl acetate, N-4-HPR(Sigma, St. Louis, MO)이 포함된 2 ml medium으로 교체하였다. 24시간 후 원심분리한 상청액을 얻어 prostaglandin양을 정량하였다. PGE₂ enzyme immunoassay kit (Caymen, Ann Arbor, MI)를 이용하여 세포당 PGE₂ 양을 측정하였다. 각 군 간의 비교는 Mann-Whitney test로 하였고 p<0.05일 때 유의한 차이가 있다고 하였다.

경과 시간에 따른 Cox-2 mRNA 발현
   단층배양된 medium을 0.01% DMSO가 포함된 medium으로 교체 0시간, 1.5시간, 3시간, 6시간, 12시간, 24 시간 후에 0.5 ml의 4 mol/L guanidinium isothiocyanate 용액을 넣어 세포들을 용해시키고 용해된 세포들을 찰과하여 DNA를 전단시켜 spectrophotometer를 이용하여 RNA 농도를 측정하였다. 
   agarose gel을 만들어 중합(polymerization)후 RNA를 gel을 전기영동, 전이(transfer)하여 완충액으로 prehybridization을 시켰다. Random-priming kit(Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, IN)를 이용하여 human Cox-2(PhD Johnes DA, Eccles Institute of Human Genetics, Salt Lake, Utah)와 18S(Promega, Madison, MI)로 probe를 준비하여 24시간동안 hybridization시켰다. membrane을 자가방사기록(autoradiography)에 노출시켜 computer densitometry(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)로 정량하였다.

N-4-HPR 농도변화에 따른 PGE₂ 생성과 Ｃox-2 mRNA의 발현
   0 μM, 0.1 μM, 0.5 μM, 1 μM, 5 μM N-4-HPR이 포함된 medium으로 PGE₂ 측정검사를 하였고 교체 3시간과 24시간 후에 Ｃox-2 mRNA에 대한 northern analysis를 시행하였다. 

Cyclooxygenase 활성에 대한 N-4-HPR의 영향
   대조군과 N-4-HPR 처치군으로 나누어 대조군은 0.01% DMSO가 포함된 medium으로 교체하고 N-4-HPR 처치군에는 1 μM의 N-4-HPR이 포함된 medium으로 교체하였다. 용해질의 단백질 함량은 modified micro-Lowry assay(Sigma, St. Louis, MO)방법으로 측정하였다. 
   100 μl 용해질과 10 μM arachidonic acid가 있는 100 μl reaction buffer를 혼합한 후 37°C에서 30분간 반응시켰다. Liquid nitrogen으로 반응을 정지시킨 후 16,000 g에서 1분간 원심분리를 하였고 상층액의 PGE₂ 양을 PGE₂ enzyme immunoassay kit로 측정하여 cyclooxygenase 활성(PGE₂ 양/ mg protein×min)을 구하였다. 대조군과의 비교는 Mann-Whitney test로 하였고 p<0.05일 때 유의한 차이가 있다고 하였다

결     과

MDA 886Ln 편평암종 세포의 PGE₂ 생성에 대한 네 종류 레티노이드의 효과 
   네 종류의 레티노이드를 투여 후 PGE₂ 생성에 대한 결과(평균±표준편차)는 대조군은 0.095±0.010 pg/ml/cell, retinyl acetate는 0.062±0.004 pg/ml/cell, all-trans-retinoic acid는 0.059±0.004 pg/ml/cell, 13-cis-retinoic acid는 0.064±0.003 pg/ml/cell, N-4-HPR은 0.012±0.002 pg/ml/cell 이었다(Fig. 1). 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 네 종류 레티노이드 모두 PGE₂ 생성을 억제하였는데 특히 N-4-HPR이 가장 많이 PGE₂ 생성을 억제하였다(p=0.029).

시간 경과에 따른 Cox-2 mRNA의 발현
   상부에 있는 band 들은 Cox-2 mRNA이고 하부에 있는 band 들은 18S RNA이다. 18S RNA로 표준화하면 0시간일 때 0.257, 1.5시간일 때 0.413, 3시간일 때 1.221, 6시간일 때 0.259, 12시간일 때 0.203, 24시간일 때 0.157이었다(Fig. 2). Medium 교체 후 시간에 따른 Cox- 2 mRNA의 변화는 교체 후 3시간까지는 Cox-2 mRNA가 증가하다 3시간 일 때 정점을 이루고 이후에는 감소하는 양상을 관찰할 수 있었다. Medium 교체 3시간 후에 Cox-2 mRNA가 가장 명확하게 발현되었다.

N-4-HPR 농도변화에 따른 PGE₂ 생성과 Ｃox-2 mRNA의 발현
   N-4-HPR의 용량 증가에 따른 PGE₂ 생성결과(평균±표준편차)는 N-4-HPR의 농도가 0 μM 일 때 0.068±0.005 pg/ml/cell, 0.1 μM일 때 0.048±0.008 pg/ml/cell, 0.5 μM 일 때 0.014±0.002 pg/ml/cell, 1 μM일 때 0.014±0.002 pg/ml/cell, 5 μM일 때 0.010±0.001 pg/ml/cell 이었다. N-4-HPR의 농도가 증가함에 따라 PGE₂ 생성이 감소하는 양상을 보이고 있다(Fig. 3). 3시간 후의 northern analysis 결과는 18S RNA로 표준화하면 0 μM 일 때 3.263, 0.1 μM일 때 3.715, 0.5 μM 일 때 3.992, 1 μM일 때 4.298, 5 μM 일 때 4.485 이었다(Fig. 4A). 용량증가에 따라 감소되는 PGE₂ 생성결과와는 다르게 대조군과 비교해 Cox-2 mRNA가 증가하는 양상을 보였다. 24시간 후의 northern analysis결과는 0 μM 일 때 0.337, 0.1 μM일 때 0.340, 0.5 μM 일 때 0.479, 1 μM일 때 0.917, 5 μM일 때 0.980이었다(Fig. 4B). 24시간 후의 Cox-2 mRNA도 PGE₂ 생성결과와는 정반대로 증가하는 양상을 보였다.

Cox-2 protein에 대한 N-4-HPR의 영향
   대조군(0시간)은 1054 arbitrary unit(a.u.)이었고 대조군(3시간)은 1712 a.u., N-4-HPR 투여군은 2036 a.u.이었다(Fig. 5). 대조군(0시간)에 비해 대조군(3시간), 즉 medium 교체 3시간 후에는 Cox-2 protein이 증가하였고 N-4-HPR 투여군은 대조군(0시간) 뿐만 아니라 대조군(3시간)과 비교하여도 Cox-2 protein이 증가하였다.

Cyclooxygenase 활성에 대한 N-4-HPR의 영향
   Cyclooxygenase 활성에 대한 결과(평균±표준편차)는 대조군은 0.188±0.023 pg/mg protein×min이었고 N-4-HPR 처치군은 0.085±0.024 pg/mg protein×min이었다(Fig. 6). 대조군에 비해 N-4-HPR 처치군이 cyclooxygenase 활성을 통계학적으로 유의하게 억제하였다(p=0.029).

고     찰

   본 연구에서 두경부 편평세포암종 세포주를 사용한 이유는 두경부암의 90%이상이 편평세포암이고 두경부 부위는 chemoprevention의 효과여부를 판정하기에 적합한 부위이기 때문이다. 본 연구에서 사용된 세포주인 MDA 886Ln은 64세 남자 후두의 편평세포암종에서 전이된 림프절에서 유래한 세포주이다.
   Fidler-Nagy 등⁶⁾은 쥐의 복막 대식세포, 사람의 피부 섬유모세포에 레티노이드의 일종인 Ro 23-6457과 Ro 23-2895를 투여하여 PGE₂ 생성이 억제되는 것을 보고하였고 ElAttar 등⁷⁾은 구강 편평세포암종 세포주인 SCC- 25에 13-cis-RA를 포함한 네 종류의 레티노이드를 투여하여 PGE₂ 생성이 현저히 감소되는 것을 관찰하였다. 본 연구에서도 두경부 편평세포암종 세포주인 MDA 886 Ln에 네 종류의 레티노이드를 투여하여 PGE₂ 생성을 억제하는가를 보았는데 대조군에 비해 네 종류의 레티노이드 모두 PGE₂ 생성을 통계적으로 유의하게 억제하였다. 특히 N-4-HPR이 네 종류의 레티노이드 중에서 PGE₂ 생성을 가장 많이 억제하였는데 ElAttar 등⁸⁾이 구강 편평세포암종 세포주에서 레티노이드로서 N-4-HPR, all-trans-RA, retinol과 카로테노이드로서 β-carotene, canthaxanthin를 투여 후 PGE₂ 생성의 억제 정도를 비교한 결과 N-4-HPR이 가장 억제 정도가 높았다는 보고와 일치한다. 
   Cox-2를 유발하는 물질로 알려진 것은 혈청, PDGF 또는 TGF-β등의 growth factor, interleukin-1, lipopolysaccharide, phorbol ester 등이 있다.⁹⁾¹⁰⁾ 본 연구에서 medium 교체 후 시간에 따른 Cox-2 mRNA의 변화를 보았는데 medium 교체 3시간 후에 Cox-2 mRNA가 가장 높게 발현되었고 이후에는 감소하여 6시간 후에는 거의 처음 상태로 감소하였고 12시간 후에는 미미한 양상을 관찰할 수 있었다. 본 연구에 사용한 medium에는 10%의 소 태아 혈청이 포함되어 있는데 혈청은 Cox-2를 활성화하는 것으로 알려져 있다. DeWitt 등¹¹⁾은 생쥐 3T3 세포에 혈청을 투여한 결과 Cox-2 mRNA는 급격히 증가하여 1시간 후에는 정점을 이루고 이후에는 감소되어 6시간 후에는 거의 정상화되었다고 한다. 쥐 혈관 평활근세포(smooth muscle cell)에 혈청을 투여하면 Cox-2 mRNA는 1.5시간과 3시간 사이에 정점을 이루고 이런 증가는 일시적이어서 이후는 감소하여 보고자에 따라 약간의 차이가 있지만 6시간 또는 12시간 후에는 급격히 감소된 결과를 보였다고 한다.¹²⁾ 혈청이 아닌 interferon γ와 lipopolysaccharide를 생쥐 대식세포(macrophage)에 투여하였을 경우 Cox-2 mRNA는 증가하여 8시간 후에 정점이 되고 이후는 서서히 감소하였다고 한다.¹³⁾ 일반적으로 외부자극에 Cox-2 mRNA는 수 시간에 급격히 증가하였다가 이후는 감소하는 경향을 보이는데 본 연구에서도 정점에 이르는 시간에 약간의 차이만 있었고 동일한 결과를 보였다. Cox-2 mRNA가 외부자극에 수 시간에 급격히 증가하였다 감소하는 경향을 보이는 이유는 Cox-2 mRNA의 반감기는 25분 정도로 PGG₂를 PGH₂로 변환시킨 후 급속히 Cox-2는 자가 비활성화(autoinactivation)되어 분해되기 때문으로 생각된다.¹⁴⁾¹⁵⁾
   본 연구에서 N-4-HPR 농도변화에 따른 PGE₂ 생성 결과는 N-4-HPR의 농도가 증가함에 따라 PGE₂ 생성이 감소되는 양상을 보였다. N-4-HPR이 아닌 다른 레티노이드로 실험한 이전의 보고⁶⁾에서도 레티노이드의 농도가 증가함에 비례하여 PGE₂ 생성이 감소되었고 ElAttar 등⁸⁾이 N-4-HPR로 한 실험에서도 농도가 증가함에 따라 PGE₂ 생성이 감소되는 양상을 보였다. 본 실험에서는 N-4-HPR의 농도를 0 μM부터 5 μM까지 하였는데 ElAttar 등⁹⁾의 실험에서는 5 μM부터 30 μM의 범위에서 한 것으로 0 μM부터 30 μM의 범위에서는 N-4-HPR의 농도가 증가함에 따라 PGE₂ 생성이 감소되는 것으로 생각된다.
   N-4-HPR의 농도변화에 따른 3시간 후의 northern analysis 결과는 N-4-HPR의 농도가 증가함에 따라 PGE₂ 생성이 감소하는 양상과는 정반대로 Cox-2 mRNA 생성이 증가하는 양상을 보였다. 또한 24시간 후의 결과도 PGE₂ 생성결과와는 정반대로 Cox-2 mRNA가 증가하는 양상을 보였다. 이런 결과로 보아 N-4-HPR의 PGE₂ 생성 억제기전은 Cox-2 mRNA 수준이 아니라고 생각된다.
   대조군 0시간에 비해 대조군 3시간, 즉 medium 교체 3시간 후에는 Cox-2 protein이 증가 하였는데 이는 medium 교체 후 Cox-2 mRNA가 증가한 nothern analysis 결과와 일치한다. Rimarachin 등¹⁴⁾이 혈관 평활근 세포에 혈청투여 후 Cox-2 protein이 증가하였다는 보고와 일치한다. 이런 결과로 보아 N-4-HPR 투여 후 3시간에는 대조군 3시간에 비해 Cox-2 protein이 증가하였는데 이는 N-4-HPR 투여 후 Cox-2 mRNA가 증가한 nothern analysis 결과와 일치한다. N-4-HPR은 Cox-2 protein 생성에 대해서도 억제하지 않아 Cox-2 protein 수준도 아니라고 생각된다. Mestre 등¹⁶⁾의 보고에 의하면 사람의 구강 상피암 세포에서 epidermal growth factor(EGF)에 의해 Cox-2 mRNA, protein의 발현이 증가되었고 all-trans retinoic acid(RA), 9-cis-RA, 13-cis-RA, retinyl acetate를 투여한 결과 EGF에 의해 증가된 Cox-2 mRNA, protein이 감소되었다고 한다. 본 연구에서는 EGF가 아니고 혈청에 의해 Cox-2 mRNA, protein의 발현이 증가되었지만 N-4-HPR 투여 후 Cox-2 mRNA, protein이 증가된 결과는 Mestre 등¹⁶⁾의 결과와는 정반대이다. 이런 결과로 보아 N-4-HPR의 작용기전은 다른 레티노이드와는 다른 것으로 추측된다.
   Pruzanski 등¹⁷⁾은 쥐 골아세포(osteoblastic cell)에서 interleukin-1, tumor necrosis factor와 platelet-derived growth factor(PDGF), epidermal growth factor(EGF), basic fibroblast growth factor(bFGF)를 동시에 투여하면 PGE₂ 생성이 증가하였는데 sPhospholipase A₂(sPLA₂) mRNA는 대조군에 비해 PDGF는 감소, EGF와 bFGF 는 증가하였고 Cox-2의 mRNA는 전부 감소하였다. 반면 cPLA₂ mRNA에 대해서는 영향이 없었다고 한다. PGE₂ 생성이 증가하면서 Cox-2 mRNA는 증가하지 않고 감소한 결과는 PGE₂ 생성과 Cox-2 mRNA 증감이 서로 일치하지 않을 수 있다는 것을 보여준다. 이런 결과는 본 연구에서 PGE₂생성과 Cox-2 mRNA 증감이 서로 일치하지 않은 결과와 유사하다. 특히 PDGF의 경우에는 PGE₂ 생성을 촉진하면서 sPLA₂, Cox-2 각각의 mRNA는 억제하여 서로 상반된 결과를 보여준다. 이는 PLA₂, Cox-2 mRNA이 억제되어도 PGE₂생성이 증가될 수 있다는 결과로서 PDGF는 PLA₂, Cox-2의 mRNA 수준에 작용하는 것이 아니라고 추정된다. 또한 PGE₂ 생성을 촉진하는 동일계통의 growth factor이더라도 종류에 따라 Cox-2는 아니지만 sPLA₂ mRNA에 대해 서로 다른 작용을 하였다는 결과는 본 연구에서 N-4-HPR이 다른 레티노이드와 다르게 Cox-2 mRNA에 대해 서로 다른 작용을 한 것과 유사하다. Rimarachin 등¹⁴⁾은 쥐 대동맥 평활근 세포에 PDGF와 EGF를 투여하면 Cox-2 mRNA가 강하게 유발된다고 보고하였는데 이런 결과는 Pruzanski 등¹⁷⁾의 보고에서 PDGF, EGF에 의해 Cox-2 mRNA가 억제되는 결과와는 반대이다. 이는 조건에 따라 PDGF와 EGF가 Cox-2 mRNA를 촉진하기도 하고 억제할 수도 있다는 것을 보여준다.
   전체적인 cyclooxygenase 활성의 조절은 두 가지 기전으로 생각할 수 있는데 하나는 효소의 합성과 분해를 조절하여 결과적으로 효소의 질량(mass)을 조절하는 것이고 다른 하나는 일정한 질량에서 활성제(activator) 또는 억제제로 전체 활성을 조절하는 것이다. 본 연구에서 대조군에 비해 N-4-HPR 처치 후에는 cyclooxygenase 활성이 억제되는 것을 볼 수 있었다. 이는 N-4-HPR의 PGE₂ 생성 억제 기전이 cyclooxygenase의 mRNA와 protein에 작용하는 것이 아니고 cyclooxygenase의 활성을 억제함으로써 일어나는 것으로 추정된다. Cox-2의 mRNA와 protein이 증가한 것은 cyclooxygenase의 활성저하에 의한 negative feed back mechanism에 의한 것으로 사료된다. cyclooxygenase의 활성도는 Cox-1과 Cox-2를 다 포함하지만 주로 Cox-2의 활성도를 의미한다.
   PGE₂ 생성에는 두개의 rate-limiting 단계가 있는데 하나는 phospholipase A₂(PLA₂)에 의한 arachidonic acid의 방출 단계이고 다른 하나는 cyclooxygenase에 의한 arachidonic acid 가 중간산물인 PGH₂로 대사되는 단계이다. PGE₂ 생성은 Cox-2의 활성뿐만 아니라 PLA₂에 의한 arachidonic acid의 이용도(availability)에도 좌우된다고 생각된다. 레티노이드는 PLA₂에 작용한다는 연구결과들이 있다. Fawzy 등¹⁸⁾은 retinal, retinol, retinoic acid, retinol acetate가 사람의 활액(synovial fluid)내의 PLA₂의 활성을 억제한다고 보고하였다. Hope 등¹⁹⁾은 all-trans-retinoic acid와 13-cis-retinic acid가 쥐 복막 대식세포에서 arachidonic acid의 방출을 억제하였고 사람의 활액 내의 PLA₂의 활성에 대해 유력한 억제제로 작용하여 레티노이드가 PLA₂ 수준에 작용하여 항염작용을 나타낼 것으로 추정하였다. 상기 연구들은 PLA₂에 한정하여 레티노이드의 영향을 연구한 것으로 cyclooxygenase에 어떠한 영향이 있는지 알 수 없지만 N-4-HPR이 cyclooxygenase는 아니고 PLA₂에 작용할 가능성이 있다. 

결     론

   이상의 결과로 보아 N-4-HPR의 PGE₂ 생성 억제 기전은 N-4-HPR이 cyclooxygenase 자체 활성을 저하하는데 있을 것으로 생각된다. 향후 cyclooxygenase 활성에 대한 N-4-HPR의 억제기전 뿐만 아니라 N-4-HPR의 PLA₂의 영향에 대한 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.

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