교신저자：채성원, 152-703 서울 구로구 구로동 80번지  고려대학교 의과대학 이비인후-두경부외과학교실
              전화：(02) 818-6159, 6157 · 전송：(02) 868-0475 · E-mail：chaeorl@kumc.or.kr 

서     론

   이관은 태생학적으로 첫째 인두주머니에서 발생하고 상기도와 중이를 연결하여 준다. 이관은 대기압의 변화로부터 중이를 보호하고, 중이강의 배설로 역할도 하며, 기도로부터 중이를 보호한다.¹⁾ 이관의 기능이 불량하면 통기가 되지 않아 반복적인 중이염의 중요 원인이 된다.
   항균성 펩티드는 조직속에 내재하면서 면역체계의 한부분을 구성하고 있으며, 여러 미생물의 조직침투를 방어하는 기능을 하고 있다. 인체에서는 defensin, cathelicidin, histatin 종류의 항균 펩티드²⁾³⁾가 발견되었는데 이들은 상피 표면과 호중구에서 발현되며 감염에 대해 첫번째 방어체계를 담당한다. 인체 기도에서는 α-defensin과 cathelicidin LL-37/hCAP-18이 호중구에서 기원하고, β-defensin과 LL-37/hCAP-18은 호흡상피세포와 폐포대식세포에서 생성되어 기도 표면액으로 분비된다.⁵⁾⁶⁾⁷⁾ 그 외 cathelicidin은 골수, 고환, 구강점막, 혀, 식도, 자궁 경부, 질, 대장 등에서 발현된다고 보고되었다.^8)9)10)11)
   Cathelicidin은 1995년에 N-terminal cathelin 영역과 C-terminal 항균 펩티드 영역을 포함하고 있는 양자공유 분자로 처음 소개되었다.¹²⁾ 그런 분자들은 많은 포유류에서 발견되었고, 영장류, 유제류(ungulates), 설치류(rodents), 토끼에서도 발견되었다. 인체에서는 현재까지 하나의 cathelicidin-LL37/hCAP18 만이 발견 되었으며^3)9)13) Cathelicidin 유전자는 양, 소, 돼지 염색체에서는 군으로 발견되었고, 인체에서는 3번 염색체에서 단일 cathelicidin 유전자가 발견되었다.³⁾⁵⁾
   CRAMP(cathelin-related antimicrobial peptide)는 LL-37과 매우 유사하여 인체에서 cathelicidin-LL37/hCAP18의 기능과 조절을 연구하는데 유용한 모형으로 본 연구에서는 생쥐 정상 이관 점막에서 cathelicidin 항균 펩티드(CRAMP)의 발현 여부를 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

조직채취
   정상 생쥐 10마리를 대상으로 이관 조직을 채취하여, 일부는 -70°C의 냉동고에 보관하여 역전사-중합효소연쇄반응에 이용하였고, 일부 조직은 4% paraformaldehlyde(pH 7.6)에 고정하여, 파라핀 포매를 하여 4 μm두께의 절편을 만들어 면역조직화학적 염색에 이용하였다.

역전사-중합효소연쇄반응

RNA 분리
   냉동된 이관 점막 조직(50~100 mg)을 얄게 썰어 TRIzol^®(Gibco, Grand Island, NY, USA)에 넣고 균질화 시킨 후 TRIzol® 1 mL 당 200 μl chloroform을 넣고 13,000 rpm 에서 15분간 원심분리 하였다. 그 후 상층액만 새 튜브에 옮기고 500 μl isopropyl alcohol을 넣고 잘 섞어준 후 실온에서 10분간 방치하였다. 다시 13,000 rpm 으로 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 70% ethanol 로 침사(pellet)를 세척한 다음, 8,000 rpm 에서 5분간 원심분리하였다. Ethanol을 제거한 후, pellet을 건조시켜 deethyl pyrocarbonate로 처리된 증류수로 침사를 용해시켰다. 그 후 각 표본의 RNA 양을 분광 광도계(Pharmacia biotech, Cambridge, England)를 이용하여 측정하였다.

역전사-중합효소 연쇄반응
   준비된 RNA 2 μl에 DEPC water 10.5 μl를 넣어 총량을 12.5 μl로 만든 다음, 여기에 oligonucleotide 1.0 μl를 넣고 70°C 에서 2분간 가열하였다. 그리고 5 X reaction buffer 4.0 μl(50 mM Tris-HCL pH 8.3, 75 m M KCl, 3 m M MgCl₂), dNTP mix(10 m M each) 1.0 μl, RNase inhibitor 0.5 μl, M-MLV reverse transcriptase 1.0 μl을 첨가하여 총량을 20 μl로 만들었다. 그리고 42°C 에서 1시간 작용시켜 cDNA를 합성한 후 94°C에서 5분간 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 80 μl 의 DEPC water를 첨가하여 100 μl로 최종 부피를 맞추었다. β₂-microglobulin을 internal control로 사용하여 양을 조절하여 정량화 되면 CRAMP primer(Bioneer, Korea)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 시행하였다. 중합효소 연쇄반응때 10 X reaction buffer(100 m MTris-HCl pH 8.3, 500 m M KCl, 15 m M MgCl₂)를 사용하였으며, 조건은 94°C에서 2분 변성을 시행한 후, 94°C-30초, 58°C-30초, 72°C-30초를 30회 반복하고 72°C에서 5분간 신장을 시행하였다. 증폭에 사용된 Oligonucleotide primer는 cathelicidin：sense strand 5'-GCTGATGTCAAAAGAATCAGCG-3'(nucleotides 10~32)와 antisense strand 5'-TCCCTCTGGAACTGCATGGTTCC-3'(nucleotides 357~378)이었다. 증폭된 중합효소연쇄반응 산물 10 μl를 2 μl gel-loading buffer와 혼합한 후 1.5% 한천겔(agarose gel)에 5 μl/ml ethidium bromide로 염색을 하여 100 voltage에서 전기영동시켜 자외선 하에서 Polaroid photograph를 촬영하였다. mRNA 발현량은 음영 계측기를 이용하여 측정하였고 GAPDH의 발현과 비교하였다. 양성 대조군으로는 CRAMP가 잘 발현되었던 생쥐의 골수조직을 사용하였다.

면역조직화학적 염색 및 관찰
   파라핀 조직 슬라이드를 탈파라핀 시키고 에탄올로 함수화 시킨 후 내인성 페록시다아제 활성을 억제시키기 위하여 0.3% H₂O₂로 15분간 처리하고 인산완충용액(pH 7.6)으로 세척하였다. 비특이적 항원 항체반응을 억제하기 위하여 30분간 정상 마우스혈청으로 처리한 후 다클론성 항체 1：100 cathelicidin(Santa Cruz Biotechnology, Inc, CA, USA)으로 4°C에서 24시간 동안 처리하였다. 이차항체로 biotinylated anti-rabbit IgG를 사용하여 30분간 반응시켰다. 인산완충용액으로 세척 후 avidin-biotin-peroxidase complex에 30분 반응 시킨 후, 발색제로는 AEC(3- amino-9-ethyl-carbazole) 용액과 5분간 반응 시켰다. 대조염색은 Meyer's hematoxylin으로 1분간 반응시켰고, 음성 대조군은 위 과정 중 일차항체 대신 인산완충용액을 사용하였다.

결     과

   생쥐 이관점막에서 CRAMP의 면역조직화학적 염색과 mRNA의 발현은 이관 중앙부의 전체 둘레에 걸쳐 시행하였고, 이관의 비인강쪽과 원위부에서도 시행하였다(Fig. 1).

CRAMP mRNA의 발현
   생쥐 이관 점막에서 분리한 총 RNA에서 GAPDH 발현을 확인함으로써 RNA 통합성과 RT-PCR의 적합성 여부를 확인하였고, 모든 이관점막조직에서 348 bp 크기의 산물을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).

면역조직화학적 검색
   CRAMP가 생쥐 이관점막 상피세포의 전층에 걸쳐 발현되었으며, 점막하 분비선에서는 일부 관찰되었으나(Fig. 3A1 and A2), 음성 대조군에서는 관찰되지 않았다(Fig. 3B1 and B2).

고     찰

   항균성 펩티드는 조직속에 내재하면서 미생물 감염시 일차적 방어 작용을 하며 내인성 항생제로 광범위한 병원체를 인지하고 면역체계가 반응하기 전에 병원체를 신속히 제거한다.^2)3)15) 인체에서는 defensin, cathelicidin, histatin 종류의 항균 펩티드가 발견되며, 상피 표면과 호중구에서 발현되어 감염에 대해 첫번째 방어체계를 담당한다. 이런 항균 펩티드는 항균작용 외에 창상치유, 혈관생성, 선천면역에도 연관이 있다. 
   삼출성 중이염이 발생하기 위해서는 병원체가 비인강 점막에 부착되어 이관을 통해 중이강 내로 들어가야 하며, 중이점막 방어기전과 면역체계를 극복해야 한다.¹⁾ 이관 및 중이 점막이 삼출성 중이염의 발생과 방어에 중요한 역할을 하는데 아직 이관 및 중이 점막의 생태학(biology)에 대해서는 잘 알려져 있지 않다. 이관의 점액섬모 수송체계와 점막 상피세포에서 분비되는 선천면역 물질들은 병원균의 침입에 대한 효과적인 방어에 장벽 역할을 하고, 중이강의 무균상태를 유지하게 한다. 이관 및 중이의 항상성은 점액(mucins), 아쿠아포린(aquaporins), 표면활성물질(surfactants), 항균 분자(anti-microbial molecules)에 의해 유지되고, 이관의 선천면역 체계에는 beta defensins, lysozyme, lactoferrin, surfactant protein A, D 등이 포함된다.¹⁾
   Cathelicidin은 여러 포유동물에서 발견되는 항균 펩티드의 전구물질로서, 돼지에는 protegrin과 PR-39, 소에는 bactenecin과 indolicidin, 토끼에는 CAP18, 생쥐에는 CRAMP가 있고, 인체에서는 현재까지 하나의 cathelicidin-LL37/hCAP18 만이 발견 되었다. Cathelicidin-LL37/hCAP18은 인체에서 골수에 가장 많이 분포하고, 이 외에도 폐, 기관, 신장, 방광, 고환, 자궁, 전립선, 위장관계, 간, 췌장, 흉선, 뇌 등에서 발현되며, 정상 각질형성세포에서는 발현되지 않으나 피부에 염증이나 손상이 있는 경우 발현된다.^{16)17)18)19)20)} Cathelicidin-LL37/hCAP18은 락토페린(lactoferrin), 리소자임(lysozyme) 등과 같은 다른 항균 단백과 상승작용이 있으며, 그람 양성균과 그람 음성균에 대한 광범위한 살균작용이 있는 것으로 알려져 있다. 또한 세균의 지질다당질(lipopolysaccharide)과 결합하여 중화시키고, 말초 단핵구(Monocytes), 호중구, CD4 T lymphocytes에 대한 화학 주성 작용이 있다. Hase 등¹⁰⁾은 인체 대장점막에서 cathelicidin-LL37/hCAP18은 tumor necrosis factor alpha, interleukin 1α(IL-1α), gamma interferon, 지질다당질(lipopolysaccharide), IL-6에 의해 발현이 증가되지 않고, 정상 대장점막과 염증성 대장점막 사이에 발현 형태에도 차이가 없고, Samonella serovar Dubin과 en-teroinvasive Escherichia coli 감염에서 약간 발현이 증가한다고 하였으며 Nilsson 등¹⁶⁾은 편평상피세포에서 IL- 6에 의해 hCAP18의 발현이 증가한다고 하였다.
   생쥐에서 CRAMP는 9번 염색체 원위부에서 발견된 항균 작용을 갖고 있는 유일한 cathelicidin 계열의 유전자로서 주로 호중구에서 발현되는 것으로 알려져 있다.⁸⁾ 골수유전자로 cathelin-like domain을 포함하고 있는 B9이 생쥐에서 발견되었지만 아직 항균 작용에 대해서는 알려져 있지 않다. Pestonjamasp 등¹⁴⁾은 CRAMP 유전자(Cnlp) 배열을 확인하여 다른 포유류 동물의 cathelicidin과 유사하고, 특히 cathelicidin-LL37/hCAP18유전자(CAMP)와 유사하다고 하였다. CRAMP는 골수에서 가장 많이 발현되고 고환, 위장관계, 비장, 심장, 폐, 골격근에서도 발현되고, 간, 신장, 뇌 등에서는 발현되지 않는다. Dorschner 등¹⁹⁾은 인체 피부와 생쥐 표피에서 무균성절개 또는 생쥐에서 group A Streptococcus 감염 후에 cathelicidin발현이 증가한다고 하였다. Gallo 등⁸⁾은 생쥐의 배자발생 과정에서 CRAMP가 배아 12일째부터 발현되어 이후 증가하고, CRAMP RNA가 비면역세포에서도 발현된다고 하였고, 이러한 것은 CRAMP가 여러 조직세포에 의해서 생성된다는 것을 시사해 준다.
   CRAMP는 LL-37과 매우 유사하여 인체에서 cathelicidin-LL37/hCAP18의 기능과 조절을 연구하는데 유용한 모형으로, 본 연구에서는 생쥐 정상 이관 점막에서 cathelicidin 항균 펩티드(CRAMP)의 발현 여부를 관찰하고자 하였다. CRAMP는 면역조직화학적 염색에서 생쥐 이관점막과 점막하분비선에서 발현되었고, 역전사-중합효소연쇄반응으로 CRAMP mRNA를 확인하였다. 이는 CRAMP가 생쥐 이관점막에 존재하면서 병원균에 대한 일차적인 숙주 방어 기전에 관여하고, 중이 감염에 대한 숙주의 저항성을 증가 시키는 것을 시사한다. 음성 대조군에서는 일부에서 약한 염색소견이 관찰되었으나 이것은 비특이적 반응으로 생각된다(Fig. 3B1).
   향후 정상 점막과 염증성 점막에서의 발현여부차이를 연구하고, 인체의 이비인후과적 질환에서의 cathelicidin발현 양상을 연구하여 병원균의 침입과정에서 인체의 방어 작용과 병원균의 활성화 정도에 미치는 영향을 연구하는 것이 필요하리라 생각된다. 

결     론

   Cathelicidin은 생쥐 이관 점막과 점막하 분비선에 존재하며, 이관 점막 방어 기능의 일부를 담당할 것으로 생각된다. 

1. Lim DJ, Chun YM, Lee HY, Moon SK, Chang KH, Li JD, et al. Cell biology of tubotympanum in relation to pathogenesis of otitis media-a review. Vaccine 2001;19:S17-25.

2. Bals R. Epithelial antimicrobial peptides in host defense against infection. Respir Res 2000;1:141-50.

3. Hancock REW, Diamond G. The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defenses. Trends in Microbiology 2000;8:402-10.

4. Larrick JW, Lee J, Ma S, Li X, Francke U, Wright SC, et al. Structural, functional analysis and localization of the human CAP18 gene. FEBS Lett 1996;398:74-80.

5. Sorensen O, Cowland JB, Askaa J, Borregaard N. An ELISA for hCAP-18, the cathelicidin present in human neutrophils and plasma. J Immunol Methods 1997;206:53-9.

6. De Yang, Chen Q, Schmidt AP, Anderson GM, Wang JM, Wooters J, et al. LL-37, the neutrophil granule-and epithelial cell-derived cathelicidin, utilizes formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) as a receptor to chemoattract human peripheral blood neutrophils, monocytes, and T cells. J Exp Med 2000;192:1069-74.

7. Sorensen O, Arnljots K, Cowland JB, Bainton DF, Borregaard N. The human antibacterial cathelicidin, hCAP-18, is synthesized in myelocytes and metamyelocytes and localized to specific granules in neutrophils. Blood 1997;90:2796-803.

8. Gallo RL, Kim KJ, Bernfield M, Kozak CA, Zanetti M, Merluzzi L, et al. Identification of CRAMP, a cathelin-related antimicrobial peptide expressed in the embryonic and adult mouse. The J of Biological Chemistry 1997;272:13088-93.

9. Weinberg A, Krisanaprakornkit S, Dale BA. Epithelial antimicrobial peptides: Review and significance for oral applications. Crit Rev Oral Biol Med 1998;9:399-414.

10. Hase K, Eckmann L, Leopard JD, Varki N, Kagnoff MF. Cell differentiation is a key determinant of cathelicidin LL-37/human cationic antimicrobial protein 18 expression by human colon epithelium. Infect Immun 2002;70:953-63.

11. Bals R, Wang X, Zasloff M, Wilson JM. The peptide antibiotic LL-37/hCAP-18 is expressed in epithelia of the human lung where it has broad antimicrobial activity at the airway surface. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:9541-6.

12. Zanetti M, Genaro R, Romeo D. Cathe.licidins: A novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain. FEBS Lett 1995;374:1-5.

13. Lehrer RI, Ganz T. Cathelicidins: A family of endogenous antimicrobial peptides. Curr Opin Hematol 2002;9:18-22.

14. Pestonjamasp VK, Huttner KH, Gallo RL. Processing site and gene structure for the murine antimicrobial peptide CRAMP. Peptides 2001;22:1643-50.

15. Huttner KM, Bevins CL. Antimicrobial peptides as mediators of epithelial host defense. Pediatr Res 1999;45:785-94.

16. Frohm Nilsson M, Sandstedt B, Sorensen O, Weber G, Borregaard N, Stahle-Backdahl M. The human cationic antimicrobial protein (hCAP18), a peptide antibiotic, is widely expressed in human squamous epithelia and colocalizes with interleukin-6. Infect Immun 1999;67:2561-6.

17. Bals R, Weiner DJ, Moscioni AD, Meegalla RL, Wilson JM. Augmentation of innate host defense by expression of a cathelicidin antimicrobial peptide. Infect Immun 1999;67:6084-9.

18. Frohm M, Agerberth B, Ahangari G, Stahle-Backdahl M, Liden S, Wigzell H, et al. The expression of the gene coding for the antibacterial peptide LL-37 is induced in human keratinocytes during inflammatory disorders. J Biol Chem 1997;272:15258-63.

19. Dorschner RA, Pestonjamasp VK, Tamakuwala S, Ohtke T, Rudisill J, Nizet V, et al. Cutaneous injury induces the release of cathelicidin anti-microbial peptides active against group A Streptococcus. J Invest Dermatol 2001;117:91-7.

20. Wu H, Zhang G, Minton JE, Rose CR, Blecha F. Regulation of cathelicidin gene expression: Induction by lipopolysaccharide, interleukin-6, retinoic acid, and Salmonella enterica serovar typhimurium infection. Infect Immun 2000;68:5552-8.