교신저자：정종우, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
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서     론

   진핵세포(eukaryotic cell)는 공포 시스템(vacuolar system) 이라고 불리는 내부적으로 산성화된 내막 시스템(endomembrane system)을 가지고 있는데 이는 양자 펌프(proton pump, H⁺-ATPase)를 이용하여 낮은 내부의 pH를 유지하도록 함으로써 세포들로 하여금 다양한 중요한 기능을 수행하게 한다.¹⁾²⁾
   대부분 신체의 체액의 pH는 매우 적은 변화의 폭으로 정상적으로 유지되고 있으며 pH의 조그만 변화에도 중요한 대사적, 발육상의 변화를 일으킬 수 있다.³⁾ 세포내 H⁺ 이온은 H⁺-ATPase에 의해 능동적으로 세포외로 분비되며 H⁺-ATPase는 F, P, 그리고 V의 세가지 종류로 분류된다. 이들 중 vacuolar type H⁺-ATPase(V-H⁺-ATPase)는 가장 최근에 분류된 것으로 공포막의 주된 이온 펌프이며 동물의 원형막의 주된 에너지원으로 알려져 있다.⁴⁾ V-H⁺-ATPase는 대부분의 진핵세포의 기능적 그리고 기초적인 역할을 한다고 생각되며 다양한 종류의 세포 소기관과 세포막에 에너지를 공급하는 등 넓은 범위의 역할을 한다. 알려진 바로는 이들은 남성 생식기능(male fertility), 파골세포에서 골흡수 기능, 시냅스 소낭(synaptic vesicle)으로의 신경 전달물질의 축적, 신장세포에서 운송시스템의 에너지 공급원, 그리고 안구 조직에서 중요한 역할을 수행한다.⁴⁾
   Stankovic 등⁵⁾은 면역조직화학법(immunohistochemical staining)을 이용하여 기니픽의 내이의 V-H⁺-ATPase와 Cl^--HCO₃^- 교환체의 분포정도를 조사하였는데 이들은 첨부의 원형막(apical plasma membrane)과 선조부의 변연 세포에 주로 많이 분포하였으며 특히 변연 세포의 V-H⁺-ATPase는 와우의 내림프와 닿는 첨부에 주로 분포하고 있다고 보고하였다. 또한 내유모세포, 코티기관의 root 세포와 지지세포(supporting cells), 나선인대(Spiral ligament)의 type 1 섬유세포들에서도 분포하였다. V-H⁺-ATPase는 미토콘드리아의 F₁,F₀-APTase, 원형막의 E₁,E₂-ATPase와 비교할 때 몇 가지 억제인자에 분명한 감수성을 지니고 있는데 최근 스트렙토마이시즈 균주(Streptomyces griseus)로부터 분리된 macrolide계 항생물질인 bafilomycin(bafilomycin A₁, C₃₅H₅₈O₉)이 V-H⁺-ATPase의 매우 선택적인 억제물로 알려졌으며⁶⁾⁷⁾ V-H⁺-ATPase에 의한 전기적인 H⁺ 이온의 배출의 변화가 와우내 전위(endocochlear potential, EP)과 연관이 있을 것으로 추측되는데 와우의 세포들 중 산의 배출과 와우내 전위를 발생시키는 주된 역할을 하는 세포는 혈관조의 변연 세포 등이며 이러한 가능성은 Carbonic anhydrase blocker인 acetazolamide가 EP를 변화시킬 수 있다는 이전의 연구에서도 제시되어 왔다.^8)9)10)11) 와우내 전압이 약간의 변화만 생겨도 청신경의 전달속도에 많은 영향을 미칠 수 있기 때문에 H⁺ 이온의 내림프 내로의 배출은 생리학적으로 매우 중요한 의미를 지닌다.¹²⁾¹³⁾
   저자들은 정상적인 청력을 가진 기니픽의 정원창에 bafilomycin을 투여하여 V-H⁺-ATPase억제에 따른 청력역치와 와우내 전위의 변화를 관찰하여 청력저하의 원인과 기전을 알아보고자 하였다. 

재료 및 방법

실험 용액
   HBSS buffer는 HEPES 5 mM, NaCl 136.0 mM, KCl 5.4 mM, Na₂HPO₄ 0.34 mM, D-glucose 5.5 mM, MgSO₄ 0.81 mM, KH₂PO₄ 0.44 mM, CaCl₂ 1.25 mM을 1 L의 H2O에 섞고 pH를 7.4로 맞추고 4℃에서 보관한 것을 사용하였다.
   Bafilomycin(bafilomycin A₁, C₃₅H₅₈O₉)은 10% DMSO에 1：10의 비율로 녹여 stock solution(100 mM)을 만들고 HBSS buffer에 각각 1, 5, 10 mM의 농도가 되도록 녹여서 사용하였으며 대조군(control solution)으로는 같은 vol%를 갖는 DMSO와 HBSS buffer를 사용하였고, 이들의 osmolarity는 실험용액과 동일하였다. 실험용액은 모두 Sigma Chemicals Co.(St. Louis, Mo, USA)에서 구입하였고 pH는 7.4였다. 

실험 동물 및 마취
   청력역치의 변화를 보기위한 실험동물로는 정상적인 Preyer's reflex를 보인 200~300 gm의 기니픽을 ketamine hydrochloride(30 mg/kg)와 xylazine(2 mg/kg)을 섞어서 복강 내 주사하여 마취하였다. 이들은 청력역치의 변화를 관찰하기위해 대조군, 1 mM, 5 mM, 10 mM bafilomycin에 각각 3마리의 기니픽을 사용하였으며 와우내 전위의 변화를 관찰하기 위해 각각 1마리의 기니픽을 사용하였다.

청력역치의 측정 
   청력역치는 청성뇌간반응(auditory brainstem response)을 이용하여 측정하였다. 청성뇌간반응은 Traveler Express(Bio-logic Systems Co., Mundelein, IN, USA)를 사용하여 검사하였다. 자극음은 초당 13회의 교대상 클릭음을 90 dB HL의 강도부터 단계별로 10 dB 낮추며 측정하였고, 파형이 불분명하게 나오는 음의 강도에 도달하면 5 dB씩 조절하면서 청력 역치를 측정하였다. 청력역치는 wave Ⅰ을 기준으로 정상적인 wave Ⅰ이 추적되는 강도를 청력역치로 정하여 측정하였다. 클릭음의 주파수필터는 100~3000 Hz로 조절하였고, 총자극음의 횟수는 1,024회로 하였다. 

정원창의 노출 및 청력역치의 변화측정 
   우선 기니픽 두부의 털을 제거한 후 청성뇌간반응을 측정하기 위해서 patch type의 전극을 EEG paste에 묻혀서 좌우 유양동 부위와 두정부, 후두부 피부에 고정하고 정상 청력을 측정하였다. 이후 기니픽 귓바퀴의 내측으로 약 1.5 cm 길이의 피부절개를 시행하고 Beckman 2×2 prong retractor를 고정한 후 골성 외이도의 후내측 부분의 골포를 드릴을 이용하여 개방하여 와우의 정원창을 확인하였다. 기니픽의 정원창 노출 이후 개방시 청력에 영향이 없었는지 다시 한번 청력을 측정한 후 약물을 200 μl씩 gelfoam에 묻혀서 정원창에 유치시킨 후 시간별로 청력역치의 변화를 측정하였다. 

와우내 전극 삽입 후 약물농도에 따른 와우내 전위의 변화측정 
   기니픽의 와우내 전위를 측정하기 위해 같은 방법으로 피부절개를 시행하고 유양동을 드릴로 개방한 뒤 고막과 이소골을 확인한 뒤 이소골을 제거하여 정원창 및 와우의 회선을 확인한 후 현미경 하에서 기니픽 와우의 두번째 회선부에 Rosen pick을 이용하여 골성미로에 구멍을 뚫었다. 이후 내림프액의 유출이 없음을 확인하고 tungsten micro needle(2.0 Mohm, WPI, USA)을 막성미로를 뚫고 삽입한 뒤 정확히 중간계(scala media)내에 삽입되었는지를 확인하기 위해 와우내 전위를 측정하여 확인한 후 역시 약물을 200 μl씩 gelfoam에 묻혀서 정원창에 유치시킨 후 와우내 전위의 변화를 시간별로 측정하였다(Figs. 1 and 2).
   측정기기로는 micromanipulator M3301R+M-3(WPI, Sarasota, USA)에 DAM60 amplifier(WPI)를 부착하여 사용하였으며 증폭정도는 DC 100배로 하였다. 와우내 전위 측정 프로그램으로는 comizoa CP-201 hardware/software(COMIZOA CO., LTD., Daejeon, Korea)를 사용하였다. 

통계 처리 
   결과값은 평균±표준편차로 표시하였고, 통계학적인 분석은 SAS version 6.12(SAS Institute Inc., USA)를 사용하였으며, 대조군과 실험 군 사이에 차이가 있는지 여부를 보기 위해서 paired t-test를 수행하였다. 

결     과

Bafilomycin의 농도에 따른 기니픽 청력역치의 변화
   대조군으로는 같은 양의 HBSS buffer를 사용하였고 1, 5, 10 mM bafilomycin을 기니픽의 정원창에 투여하여 시간별 청력역치의 변화를 측정하였다. 투여후 2시간 경과 후 측정한 청력역치는 대조군 21.6±2.8 dB, 1 mM bafilomycin 33.3±5.7 dB, 5 mM bafilomycin 50.0±0 dB, 10 mM bafilomycin 52.5±8.6 dB로 대조군과 1 mM bafilomycin을 투여한 군에서는 2시간 경과 후까지 별다른 청력역치의 변화를 보이지 않은 반면, 5 mM과 10 mM bafilomycin 투여군에서는 약 60분 경과 이후로 각각 유의하게 청력역치가 높아졌으며 이 두 군간의 유의한 차이는 없었다(Table 1, Fig. 3).

Bafilomycin의 농도에 따른 기니픽 와우내 전위의 변화
   초기 와우내 전위는 85±10 mV였으며 약물 투여 후 측정한 와우내 전위의 변화관찰 시 대조군, 1 mM bafilomycin 투여군에서는 와우내 전위의 변화를 관찰할 수 없었으며 5 mM, 10 mM bafilomycin 투여군에서는 투여후 약 10분 경과 후부터 각각 35 mV, 19.8 mV의 전위의 감소를 관찰할 수 있었다. 이러한 와우내 전위의 변화는 20분 경과 후 약 한시간까지 변하지 않고 그대로 유지되었다(Fig. 4).

고     찰

   기저막상에 있는 내유모세포는 기저막의 진동으로 인해 비틀린 힘(shearing force)을 전달받게 되며 이러한 음압이 K⁺ 이온의 유입으로 인한 유모세포 세포막의 탈분극, 뒤이은 전압 민감성 Ca²⁺ 이온채널(voltage sensitive Ca²⁺ channel)의 개방으로 유입된 Ca²⁺ 이온으로 인한 해당 유모세포와 청신경 사이의 시냅스(synapse) 근처에서 양전위가 축적되고 glutamate 등의 신경전달 물질이 방출되어 해당 청신경에서 활동전위를 발생하게 한 후 이러한 활동 전위들이 대뇌로 전달되면서 소리로 인식되게 된다. 
   유모세포에서 일어나는 변화는 기계적인 에너지를 전기적인 에너지로 변환하는 첫 단계라고 볼 수 있으며 이러한 감각기능에 이상이 생기면 청력장애가 나타나게 되며 와우 내의 유모세포 및 코티기의 여러 세포들이 정상적인 활동을 하기 위해서는 일정한 pH 및 이온환경의 항상성이 유지되어야 한다.
   기니픽의 와우내 전위(endocochlear potential)는 그 발생기전이 아직 정확하게 밝혀진 것은 없으나 Wangemann은¹⁴⁾¹⁵⁾ 선조(stria vascularis)의 변연세포(marginal cell) 등에 의해 높은 농도의 K⁺ 이온이 분비되며 이로 인해 높은 와우내 전위가 형성된다고 주장하였으며 Wakizono 등¹⁶⁾은 기니픽 와우내 전위는 외림프액의 pH가 5에서 9사이인 경우 정상적으로 유지되며 4이하로 감소하였을 경우 가역적인 감소를, 10이상인 경우 비가역적인 감소를 보였다고 보고하여 와우내 전위가 외림프 pH의 영향을 받는다고 보고하였다. N+과 K⁺ 이온의 조절을 위해 와우내 세포에 위치한 Na⁺-K⁺ ATPase는 세포내 Na⁺ 이온과 세포외 K⁺ 이온의 농도 및 세포내 pH에 조절된다고 알려져 있으며 최적 pH는 7.3이고 pH의 증가 및 감소에 따라 활성도가 감소하게 된다.¹⁷⁾
   항생제와 이뇨제 등의 약물들이 이독성과 신독성의 부작용을 동시에 가지고 있는 사실을 바탕으로 내이와 신장이 체액과 전해질의 항상성을 유지하는데 비슷한 기전을 가지고 있을 것이라고 오래 전부터 제시되어 왔으며^9)10)18) 신장에서 pH를 조절하는데 역할을 하는 두개의 단백질이 있다는 것이 밝혀졌는데 이는 V-H⁺-ATPase와 Cl^--HCO₃^- 교환체(Cl^--HCO₃^- exchanger)로서 이미 서론에서도 언급하였듯이 내이의 조직, 특히 선조의 세포들에서도 신장에서와 같은 V-H⁺-ATPase가 존재하여 와우내 pH 조절에 관여한다고 밝혀져 있다.
   정상적인 청력감소를 일으키는 원인에 대한 연구는 많이 시행되어 왔으며 본 연구에서는 V-H⁺-ATPase의 매우 선택적인 억제물로 알려진 macrolide계 항생물질인 bafilomycin을 사용하여 기니픽의 정원창을 통한 투과로 청력역치의 저하와 와우내 전위의 감소를 관찰하고자 하였다.
   기니픽의 정원창에 각각의 약물을 투여 후 2시간 경과 후 측정한 청력 역치는5 mM과 10 mM bafilomycin 투여군에서는 각각 50.0±0 dB, 52.5±8.6 dB으로 대조군과 1 mM bafilomycin을 투여한 군에 비해 유의하게 청력역치가 낮아졌으며 이는 5 mM 이상의 bafilomycin이 와우내의 여러 세포들, 특히 선조 변연세포에 영향을 미쳐 H⁺이온의 배출이 억제되고 그 결과 와우내의 pH를 높인 결과라고 볼 수 있다. 
   또한 청력역치의 변화와 마찬가지로 와우내 전위변화에서도 5 mM, 10 mM bafilomycin 투여군에서는 투여 후 약 10분 경과 후부터 전위의 감소를 관찰할 수 있었는데 본 실험에서 청력역치는 bafilomycin 투여후 약 30분 경과 이후부터 감소하는데 비해 와우내 전위는 약 10분 정도 경과 후부터 낮아지기 시작하였으며 이러한 결과의 차이는 청력역치의 측정간격(30분)과 와우내 전위의 측정간격(1분)의 차이 때문에 보이는 결과로 해석할 수 있으며 또한 V-H⁺-ATPase의 작용방해 등으로 인해 H⁺ 이온의 배출이 억제되어 세포 간질액의 pH의 상승 및 뒤이은 와우내 전위의 감소가 일어나지만 실제로 유모세포 등의 기능저하로 인한 청력 이상이 오기까지에는 어느 정도 시간적 경과가 필요할 가능성 및 달라진 이온 및 pH환경에 대한 코티기관 내의 유모 세포 저항성에도 어느 정도 밀접한 관계가 있다고 생각할 수 있을 것이다. 이러한 결과는 추후 실시간 청력 역치 측정방법의 개발로 추가적인 실험을 하여 연구결과를 보강해야 한다고 생각한다. 

결     론

   본 연구를 통하여 기니픽의 정원창을 통해 투여된 bafilomycin에 의한 청력역치의 상승과 와우내 전위의 감소를 관찰할 수 있었으며 이러한 결과는 bafilomycin 5 mM 이상에서 동일한 결과를 보였다. 본 결과를 바탕으로 bafilomycin에 의하여 와우내 세포들, 특히 선조 변연 세포 및 기저세포 등의 V-H⁺-ATPase 기능이 저하되어 세포내pH가 낮아지고, Na⁺-K⁺ ATPase의 정상적인 기능의 소실로 내림프로의 높은 K⁺이온의 흐름을 유지하지 못하여 와우내 전위가 감소하게 되고, 유모세포 및 감각세포들의 기능 저하로 인한 청력저하를 유발한다고 생각한다. 

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