교신저자：여상원, 137-040 서울 서초구 반포동 505번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과교실
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서     론

   현대사회에서 문명의 발달과 더불어 알레르기 질환은 더욱 증가하는 반면 치료법의 개발은 별 진전을 보지 못하고 있다. 선진국에서의 유병률을 보면 계절성 알레르기비염이 전체의 10%, 통년성 알레르기비염이 전체의 10~20%를 차지하며 소아에서는 40%까지 보고되고 있다.¹⁾ 알레르기비염은 치료되지 않는다면 부비동염의 위험인자가 될 수 있으며 천식 등의 합병증을 유발할 수 있다. 약물요법은 알레르기비염의 기본적인 치료지만 약제 중단 시 재발이 흔하고 심각한 부작용을 일으킬 수 있다. 따라서 더욱 안전하고 효과적인 치료법이 필요하게 되었다. Noon²⁾에 의해 면역요법이 처음으로 시행된 이후 알레르기 질환의 치료법으로 널리 사용되어 왔지만 과민반응과 비용문제로 최근 면역주사의 사용이 줄어들고 있다. BCG(Bacillus Calmette-Guerin)는 결핵과 나병에 대한 백신으로 사용되며 알레르기 천식에서 강력한 Th1 세포의 면역반응을 유도하여 여러 가지 싸이토카인의 생성분비를 변화시켜 알레르기 기도염증을 완화시켜 기도과민성이 감소된다는 보고는 있으나³⁾ 알레르기비염에 관한 연구는 없다.
   한편 동물에서 알레르기비염 모델을 만드는 것은 알레르기비염의 기전에 대한 연구와 효과적인 치료법을 찾는데 매우 중요하다. 기존에는 주로 난알부민(ovalbumin)을 이용한 모델이 사용되어 왔으나,⁴⁾ 이것은 음식 알레르기이며 또한 우리나라에서 가장 많은 알레르기 항원은 집먼지 진드기이므로 최근에는 집먼지 진드기를 이용한 알레르기 모델이 제작되고 있다.⁵⁾ 또한 집먼지 진드기 모델의 제작은 전신감작 후 비내 국소감작을 통해 시도되어왔다.⁵⁾ 그러나 알레르기 모델의 제작방법은 가능하면 자연 상태와 유사하게 알레르기 항원에 감작되고 다시 그 항원에 의해 알레르기비염 반응이 발생하도록 해야 한다.
   따라서 본 연구는 집먼지 진드기를 이용하여 비내 국소감작만으로 알레르기비염 마우스 모델을 만들고, 이 모델에서의 BCG의 치료효과를 확인하고자 하였다. 

재료 및 방법

실험동물과 항원
   실험동물로는 특이 질병이 없는 6주된 암컷 BALB/c 마우스(20~30 g)를 사용하였다. 항원으로는 집먼지 진드기인 Dermatophagoides pteronyssinus(Der p)의 lyophilized crude body extract(연세대학교 항원은행, 서울, 한국)를 사용하였고, 항원은 4℃에서 냉장 보관하고 phosphate buffered saline(PBS)에 녹여 사용하였다.

알레르기비염 모델의 제작
   마우스 24마리를 대상으로 군당 8마리씩 3군으로 나누었다. 1군은 정상대조군, 2군은 알레르기비염군, 3군은 BCG 치료군 으로 나누었다.
   알레르기비염군은 Der p를 PBS에 섞어 25 ug/20 ul를 micropipette을 이용하여 가볍게 마취한 쥐의 양측 비강을 통하여 첫 3주는 5회/주, 다음 3주는 3회/주로, 6주간 국소 비내 흡인감작 시킨 후 7주째 연속 3일 국소 비내 감작 후 24시간 후에 희생시켰다(총 27회).
   BCG 치료군은 알레르기비염군과 같은 방법으로 국소 비내 흡인감작 시키면서 BCG(한국백신, 서울, 한국) 1×10⁵ colony-forming units/ml(CFU/ml)을 알레르기 항원의 첫 감작 일주전 처음 1회 주사 후 매주 1회씩 총 7회 경피주사하였다(Fig. 1).
   정상대조군은 알레르기비염군과 같은 방법과 횟수로 PBS 20 ul를 비내로 흡인시켰다.

항원투여 후 유발된 알레르기 증상의 비교
   마지막 항원 주입 후 15분간 마우스의 코를 비비는 동작과 재채기 숫자를 기록하여 각 군별로 서로 비교하였다.

기관지폐포세척
   각 군별로 마지막 항원흡입 후 24시간 후에 에테르를 이용해 마취한 후 개흉하였다. 좌측 주기관지는 실로 묶고 22게이지 주사바늘을 기관에 삽입하고 우측 폐에서 기관지폐포세척을 시행하였는데 0.4 ml의 PBS를 주입하고 흡입하기를 3회 반복하여 모았다. 기관지폐포세척액을 4℃, 2,000 rpm에서 7분간 원심분리하고, 상층액은 -70℃에 보관하였다. 세포침전물은 hematocytometer로 총세포수를 세고, 일부는 cytocentrifuge(Cytospin 2, Shandon, Runcorn, UK)하여 슬라이드를 만든 후 Diff-Quik으로 염색하고 400배 시야에서 최소한 300개의 세포를 세어 대식세포, 호산구, 림프구, 호중구를 감별 계산하였다.

비점막조직 소견의 비교
   마지막 항원을 주입하고 24시간 후에 마우스를 희생시켜 두부를 채취한 후 4% paraformaldehyde에 4℃에서 3일간 조직고정을 한 후에 흐르는 물에 세척한 후 Calci-Clear Rapid(Diagnostics, Atlanta, GA)에서 실온에서 3일간 탈회시킨 후 70%이상의 알코올로 수 시간에 걸쳐 단계별로 농도를 높여가며 탈수시킨 후 파라핀 블록을 만들었다. 4 μm로 조직절편을 만들어 hematoxylin eosin염색을 하여 400배 광학현미경(Olympus, Tokyo, Japan)하에서 비중격의 골-연골 이행부위의 상피하 부위 4곳에서 실험과정을 모르는 두 사람이 각각 현미경 한시야 전체에 침윤된 모든 호산구의 수를 측정하여 비교하였다. 

기관지폐포세척액내 cytokine 및 혈청내 총 IgE의 측정
   각 군별로 희생 시에 기관지폐포세척액(원심 분리한 상층액)에서 알레르기 염증반응의 지표로, Th1의 면역 반응도를 보기 위해 IFN-γ(R & D system, Minneapolis, MN), Th2의 면역 반응도를 보기 위해 IL-13(R & D system, Minneapolis, MN)을 ELISA kit를 이용하여 측정하였으며, 혈청에서 총 IgE(Pharmingen, San Diego, CA)를 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. 

통계학적 분석
   모든 변수는 평균±표준오차로 나타냈다. 각 변수간의 통계적 검정은 SPSS 프로그램을 이용하였으며 independent sample T-test를 이용하였다.

결     과

알레르기 증상의 비교
   마지막 항원 주입 후 15분간 마우스의 코를 비비는 동작과 재채기 숫자를 합한 증상점수의 평균은 정상대조군은 9.8±1.7회, 알레르기비염군은 41.7±3.5회, BCG 치료군은 12.1±1.7회였다. 정상대조군에 비해 알레르기비염군은 통계적으로 유의하게 증가되었고(p<0.001), 알레르기비염군에 비해 BCG 치료군은 유의하게 감소되었으며(p<0.001), 다른 군 간의 유의성은 없었다(Fig. 2).

비점막내 호산구의 침윤정도의 비교
   알레르기비염군의 비강 점막조직 소견상 상피세포층보다 상피밑 고유층에 염증세포 특히 호산구의 침윤이 현저하게 증가하였음을 관찰할 수 있었고, BCG 치료군에서는 현저히 감소하였음을 알 수 있었다(Fig. 3). 항원투여 후 24시간 후에 채취한 마우스의 비점막내에서 400배 광학현미경으로 관찰되는 호산구수의 평균은 정상대조군은 2.6±0.3개, 알레르기비염군은 23.8±0.8개, BCG 치료군은 5.1±0.5개 였다. 정상대조군에 비해 알레르기비염군은 통계적으로 유의하게 증가하였고(p<0.001), 알레르기비염군에 비해 BCG 치료군은 유의하게 감소하였으며(p<0.001), 다른 군 간의 유의성은 없었다(Fig. 4).

혈청 총 IgE
   혈청 총 IgE는 정상대조군(0.31±0.01 μg/ml)과 비교해 알레르기비염군(9.16±1.42 μg/ml)(p<0.001)과 BCG 치료군(4.60±0.97 μg/ml)(p<0.001)에서 통계적으로 유의하게 높았고, 알레르기비염군과 비교해서 BCG 치료군은 감소하였으나 유의성은 없었다(Fig. 5).

기관지폐포세척액의 염증세포
   정상대조군에서 총세포수는 25.87±2.48 ×10⁴/ml, 대식세포수는 25.78±2.48 ×10⁴/ml, 림프구수는 0.06±0.01 ×10⁴/ml, 호중구수는 0.01±0.01 ×10⁴/ml 였으며, 알레르기비염군에서 총세포수는 160.50±15.24 ×10⁴/ml, 대식세포수는 70.66±8.05 ×10⁴/ml, 호산구수는 64.93±17.10 ×10⁴/ml, 림프구수는 6.31±1.22 ×10⁴/ml, 호중구수는 18.58±3.23 ×10⁴/ml 였으며, BCG 치료군에서 총세포수는 27.75±7.04 ×10⁴/ml, 대식세포수는 10.86±1.51 ×10⁴/ml, 호산구수는 11.78±4.76 ×10⁴/ml, 림프구수는 0.70±0.22 ×10⁴/ml, 호중구수는 4.41±1.39 ×10⁴/ml였다. 전체세포수와 대식세포, 호산구, 림프구, 호중구는 정상대조군에 비해 알레르기비염군에서 통계적으로 유의하게 증가하였고(p<0.01), 알레르기비염군에 비해 BCG 치료군은 유의하게 감소하였다(p<0.01)(Figs. 6 and 7).

기관지폐포세척액의 싸이토카인 양상 
   기관지폐포세척액에서 측정한 IFN-γ는 정상대조군(2.42±0.14 pg/ml)에 비해 알레르기비염군(1.52±0.11 pg/ml)에서 유의하게 감소하였으며(p<0.001), 알레르기비염군에 비해 BCG 치료군(3.25±0.57 pg/ml)에서 유의하게 증가하였다(p=0.019). IL-13은 정상대조군(6.80±0.76 pg/ml)에 비해 알레르기비염군(36.75±13.39 pg/ml)(p=0.042)과 BCG 치료군(17.21±1.82 pg/ml)(p<0.001)에서 유의하게 증가하였으며, 알레르기비염군에 비해 BCG 치료군은 감소하였으나 유의성은 없었다(Fig. 8).

고     찰

   알레르기비염은 아토피질환 중 가장 흔하며 인구의 15~20% 정도에서 2세 이전에 생긴다는 보고도 있다. 알레르기비염은 알레르기 천식과 밀접한 관계를 갖고 있어 천식환자의 88%에서 알레르기비염증상과 양성피부반응검사가 나타난다고 한다.⁶⁾ 특히 동물에서 알레르기 모델을 만드는 방법은 같은 기전에 의해 동시에 알레르기 천식과 알레르기비염 모델이 만들어지는 것으로 알려져 있으며 현재까지는 알레르기 천식 모델에 관한 연구가 주를 이루며 알레르기비염 모델에 관한 연구는 드물다.
   본 연구 결과 알레르기비염군에서의 알레르기 증상, 비점막에서의 호산구수, 혈청 총 IgE, 기관지폐포세척액에서의 호산구를 포함한 염증세포 및 IL-13의 증가는 집먼지 진드기의 반복적인 국소감작에 의한 성공적 알레르기비염모델의 제작을 의미한다. Mccusker 등⁶⁾은 난알부민을 이용하여 마우스의 비강을 통한 국소감작만으로 상-하기도 모두 알레르기 염증을 유발시킬 수 있으며 이때 비강을 통해 투여되는 대부분의 항원은 비강점막에 침착된다고 하였다. 과거부터 마우스, 백서 그리고 기니픽 등에서 여러 가지 다양한 항원을 이용한 모델이 연구되어 왔으며 그 중 난알부민이 동물에서 알레르기 반응을 유발하기 위해 가장 흔히 사용되는 항원이지만 임상적으로 흔한 알레르기 항원이 아니라는 점이 임상적용에 한계가 있다. 본 연구에서 마우스를 사용한 이유는 다른 실험동물에 비해 면역학적 정보가 잘 확립되어 있어 향후 연구의 용이성을 고려하였다. 알레르기 항원 중에서 집먼지 진드기는 알레르기 질환의 가장 흔한 원인항원으로써 그중 Dermatophagoides farinae(Der f, 북아메리카 집먼지 진드기)와 Der p(유럽 집먼지 진드기)가 가장 중요한 원인으로 알려져 있으며 이를 이용한 알레르기 모델의 제작이 활발히 진행되고 있다. Cheng등⁷⁾은 마우스에서 Der p를 이용한 알레르기 동물모델을 제작하였고, Yun 등⁵⁾은 Der f 를 이용 전신감작과 비내 국소감작을 비교하였는데 전신감작후 비강국소감작을 시도하는 방법이 비강에 Der f 만을 투여하는 방법보다 효과적이라고 하였다. 하지만 이 연구는 보조제를 사용하였고 6주일동안 매주 1회씩만 국소감작을 시켜 본 연구와는 차이점이 있다. 마우스를 이용한 알레르기 동물모델은 사용한 알레르기 물질의 종류, 농도, 양, 마우스에 주는 방법, 빈도, 기간 등에 따라 각 연구실마다 매우 다양하다.⁸⁾ Johnson등⁹⁾은 7주간 집먼지 진드기와 난알부민을 각각 주 5회 국소 비내 투여하여 집먼지 진드기에 의한 알레르기 천식 모델을 만들 수 있었으며, Th2 반응과 연관된 싸이토카인이 증가하였고, 항원투여 중지 후 9주 후에는 알레르기 기도염증이 소실된다고 하였다. 본 연구에서도 7주간 총 27회의 비내 국소감작을 통해 알레르기비염모델의 제작을 확인할 수 있었으며 알레르기 염증의 소실에 대해서는 시간적 연관성에 관한 추가연구가 필요하다. 
   또한 본 연구 결과 BCG 치료군에서 알레르기비염군에 비해 알레르기 증상, 비점막에서의 호산구수, 혈청 총 IgE, 기관지폐포세척액에서의 호산구를 포함한 염증세포 및 IL-13의 감소와 IFN-γ의 증가는 BCG에 의해 알레르기비염이 억제됨을 의미한다. 알레르기 질환은 주로 알레르기 항원에 의해 유발되는 Th2 세포 반응의 강화에 의해 발생하므로, Th1 반응을 강화하여 Th2 반응을 억제하는 방법은 새로운 알레르기 질환의 치료방법으로 각광받고 있으며 이에 대한 많은 연구가 진행 중이다.³⁾¹⁰⁾ 최근 연구들에 의하면 바이러스감염 또는 세균감염에 의해 Th1 반응이 강화되어 알레르기 질환이 억제된다는 보고가 있으며, 특히 결핵을 예방하기 위해 백신으로 사용되는 BCG를 포함하는 Mycobacterium종은 강력한 Th1 반응을 유발시키는 것으로 알려져 있다. 한편 신생아때 BCG 예방접종을 하는 경우 알레르기 질환의 발생이 감소하였다는 보고가 있으며,¹¹⁾ 또한 Koh 등¹²⁾은 한국에서는 생후 4주에 모든 신생아에게 BCG백신을 투여하며 이것이 아토피의 유전성을 가진 소아에서 알레르기비염이나 천식으로의 발전을 막을 수 있다고 하였다. 
   또한 Yang 등³⁾은 알레르기 천식 모델을 만든 후 BCG를 투여하여 국소적 싸이토카인의 생성과 접착분자의 발현을 변화시켜 증상이 개선되었으나 IgE 반응에는 변화가 없다고 하였다. 그러나 본 연구에서는 혈청 총 IgE가 BCG 치료군 에서 알레르기군 과 비교해 감소하였지만 통계적으로 유의한 차이를 보이지는 않았다. 
   BCG의 항알레르기 작용의 일반적인 기전은 BCG에 포함되어 있는 CpG oligodeoxynucleotides가 항원제공세포를 자극하여 IL-12, IFN-γ 등이 분비되어 NK세포가 활성화되고 강력한 Th1 세포의 면역반응이 유도되어 알레르기 염증반응이 억제되거나 CpG가 직접 B세포에 작용하여 IgE 생산을 억제하므로서 Th2 세포반응이 억제된다고 하였다.¹⁰⁾¹³⁾
   한편 BCG의 농도와 투여시기와 방법에 관한 많은 연구가 진행되었는데 Erb 등¹⁴⁾은 BCG의 항알레르기효과는 사용량에 비례하여 증가되며 2×10⁵ CFU/ml에서 최대 억제효과가 나타나며, 항원 감작 전에 투여하는 것이 효과가 좋고, 비강내 국소투여가 경피주사보다 효과가 좋다고 하였으며, Koh 등¹²⁾은 고농도의 BCG를 사용할 경우 감작 시에 투여하여도 항알레르기 효과를 볼 수 있다고 하였다.

결     론

   본 연구를 통해 가장 흔한 호흡기 알레르기 항원인 집먼지 진드기의 반복적인 국소 비내감작만으로도 알레르기비염 모델을 만들 수 있었으며, 결핵에 대한 백신으로 사용되는 BCG 투여로 알레르기 염증이 감소됨을 확인함으로써 BCG에 의한 알레르기비염의 예방 및 치료 가능성을 보여주었다. 하지만 항원투여 중지 후 알레르기 모델의 지속성 여부, 면역적 관용, 기도개형, BCG의 농도와 투여횟수, 투여시기, 독성에 관한 더 많은 연구가 필요할 것으로 생각된다.

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