교신저자：이봉재, 138-736 서울 송파구 풍납동 388-1  울산대학교 의과대학 서울아산병원 이비인후과학교실
교신저자：전화：(02) 3010-3714 · 전송：(02) 489-2773 · E-mail：bjlee@amc.seoul.kr

서     론

   만성 부비동염 환자에서 정상인에 비해 바이러스성 비염과 세균 감염의 발생 빈도가 더 높은 것으로 나타나며,¹⁾ 특히 이들 환자들에서는 염증이 일시적으로 호전된 후 바이러스성 상기도염이 발생하여 신속히 악화되는 재발성 부비동염의 양상을 보이는 경우가 흔하다. 또한 임상에서 부비동염 환자들이 감기가 잘 걸린다고 호소하는 경우를 흔히 접할 수 있다. 지금까지 rhinovirus(RV)를 비롯한 상기도 바이러스가 부비동염의 하나의 병인인 것은 잘 알려진 사실이다. 그렇다면 반대로 부비동염 환자들이 정상인에 비하여 감기가 잘 걸리는지, 감기가 걸렸을 때 비점막에서 나타나는 생리현상에는 차이가 있는지에 대한 연구의 필요성이 제기된다.
   RV 감염은 비강, 비인강 점막 상피세포의 접착분자 ICAM-1(intercellular adhesion molecule-1) 수용체와 결합하여 바이러스가 세포 내로 진입하여 이루어진다.²⁾ 감염된 상피세포에서는 IL-6와 IL-8 같은 cytokine이 분비되고 그에 따르는 호중구의 화학주성(chemotaxis) 등을 포함한 일련의 염증반응으로 감기의 특징적인 증상이 발현된다.^3,4) RV 감염에서는 IL-6와 IL-8 이외에도 IL-1β, TNF-α, RANTES, MIP, IL-11 등도 분비되며 이러한 여러 cytokine들도 감염 시 나타나는 염증반응 형성에 관여한다.⁵⁾ 
   만성 부비동염에서 흔히 검출되는 세균으로는 Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae 등이 있으며⁶⁾ 특히 황색포도구균은 초항원(superantigen)으로 작용하는 19개 이상의 외독소를 분비한다.⁷⁾ 
   본 연구에서는 부비동염이 있는 환자의 점막에서 RV 감염에 대한 감수성이나 염증반응이 어떠한가를 연구하고자 하였다. 그러한 연구의 기초 단계로 부비동염의 병인론에서 중요한 균주로 평가되고 있는 황색포도구균의 독소가 기도상피세포주인 A549 세포에서 RV 감염에 어떠한 역할을 갖는가를 연구하였다.

재료 및 방법

바이러스
   HRV-16(Human Rhinovirus-16, ATCC, Rockville, MD)을 phosphate buffered saline(PBS)으로 희석하여 -70℃ 냉동고에 실험 시까지 보관하였다.

시  약
   SEA(Staphylococcal enterotoxin A), SEB(Staphylococcal enterotoxin B) 시약(Sigma, St. Louis, USA)은 PBS에 녹여 실험 시까지 4℃에 보관하였다.

세포의 배양
   A549(alveolar epithelial type Ⅱ respiratory cells, ATCC, Rockville, MD) 세포는 10%의 fetal bovine serum(GIBCO, Grand Island, NY)이 포함된 F-12K Nutrient Mixture(GIBCO, Grand Island, NY)를 기본 배양액으로 하여 배양하였다. 바이러스 역가(viral titer)의 측정에 사용된 MRC-5(human fetal lung fibroblast)세포는 2 mM L-glutamine, 20 mM HEPES, 100 units/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin, 0.25 μg/ml fungizone을 포함하는 MEM(minimum essential media, GIBCO, Grand Island, NY)을 기본 배양액으로 하여 5% fetal bovine serum을 첨가하여 95%의 공기, 5% CO2, 37℃의 항온, 항습 조건에서 배양하였다. 

A549 세포에 대한 HRV-16 감염과 SEA와 SEB의 처치 
   실험군은 A549 세포에 배양액만 처리된 군(대조군), 대조군에 HRV-16 감염을 시킨 군(HRV군), 대조군에 SEA를 투여한 군(SEA군), 대조군에 SEB를 투여한 군(SEB군), 감염군에 SEA를 투여한 군(HRV+SEA군), 감염군에 SEB를 투여한 군(HRV+SEB군)의 6개 군으로 설정하였다. 각 실험군에서 A549 세포를 12 well plates(Falcon Lab ware, Oxnard, CA, USA)에 한 well당 2×105가 되도록 분주하고 10% F-12K 배양액 1 ml를 넣고 배양하였다. 대조군에서는 배양액에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 0.1% 처리하여 3일간 배양하였다. 감염군에서는 대조군과 동일한 배양액과 조건에서 HRV-16을 1 MOI(multiplicity of infection)로 감염시키고 8시간 후 PBS용액으로 세포를 세척하였고 새로운 배양액으로 갈아준 후 3일 후에 실험을 종료하였다. HRV+SEA군과 HRV+SEB군에서는 HRV-16을 1 MOI로 감염시킨 후 8시간 후 PBS용액으로 세포를 세척하였고 새로운 배양액으로 갈아준 후 SEA 또는 SEB를 농도별로 5 ng/ml, 50 ng/ml, 500 ng/ml를 처리하고 3일간 배양하였다. SEA와 SEB군에서는 대조군 배양액에 SEA와 SEB를 농도별로 5 ng/ml, 50 ng/ml, 500 ng/ml를 처리한 후 3일간 배양하였다. 실험이 끝난 세포배양액을 수집하여 ELISA와 바이러스 titer 측정 실험 시까지 -70℃ 냉동고에 보관하였으며, 세포는 ICAM-1 유세포분석에 사용하였다. 

ICAM-1에 대한 유세포분석 
   대조군과 감염처리된 실험군 등 6개 군의 A549세포를 PBS 1 ml로 세척한 후 0.25% trypsin-EDTA 100 μl를 넣고 37℃에서 5분간 방치하였다. 10% F-12K 배양액 1 ml를 넣고 1,800 rpm에서 원심분리하였다. 그 후 PBS 3 ml를 넣고 세척한 후 원심분리하였고, 침전된 각 실험군 세포에 항 ICAM-1항체(mouse monoclonal anti human CD 54-FITC, Serotec, Oxford, UK)를 4 μl씩 넣었다. 음성대조군 세포에는 항체(mouse IgG1-FITC, Serotec, UK)를 4 μl씩 넣었다. 항원-항체반응은 빛이 들어가지 않도록 조심하며 4℃에서 30분간 반응시켰다. PBS로 두 번 씻고, 세포에 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)/PBS를 200 μl씩 넣고 유세포분석을 시행하였다. 시료는 FACScan 분석기(FACSCalibur；Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 유세포분석을 측정하였다. 형광강도의 단위는 제시된 숫자에 104 S/C units를 곱한 숫자이나 본 논문에서는 단위를 생략하고 절대값만을 제시하였다.

IL-1β, IL-6, IL-8 측정을 위한 ELISA 
   실험한 배양액을 수집하여 -70℃에 보관한 후 ELISA를 시행하였다. IL-1β, IL-6와 IL-8의 양은 ELISA kit(Biosource, Nivelles, Belgium)를 이용하여 분석하였다. 배양액을 100 μl씩 일차항체가 깔려있는 ELISA plate에 넣고 각각의 well에 항 IL-1β, 항 IL-6, 항 IL-8 conjugate를 50 μl씩 혼합한 후 horizontal shaker에서 700±100 rpm으로 흔들어 주었다. 그 후 세척 용액으로 3회 세척한 후 발색용액(tetrametylbenzidine in DMF)을 각 well당 200 μl씩 넣고, 빛이 없는 상태에서 700±100 rpm으로 30분간 반응시켰다. 그 후 stop 용액(1.8N H₂SO₄)을 50 μl 넣고 자외선 분광 광도계(Molecular Devices, Menlo Park, CA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 군별로 6개 sample의 평균값과 표준편차를 구하였다.

바이러스 역가의 측정 
   MRC-5 세포를 96 well plates에 한 well당 3×10⁴의 수로 10% MEM 배양액 100 μl에 넣고 배양하였다. 다음 날 상층액을 버리고 5% MEM 125 μl를 각각의 well에 넣었다. 그 위에 감염군인 HRV군, HRV+SEA군, HRV+SEB군의 상층액을 10배부터 107까지 10배씩 희석하여 25 μl씩 넣으며 각 농도당 4개의 well에 분주하였다. CPE(cytopathic effect)가 나타나는 시점까지 5일부터 2주까지 매일 관찰하며 광학현미경(OLYMPUS BX 40, Japan) 100배 시야에서 세포를 관찰하였다. 바이러스 역가는 각 희석배수의 4개 중 2개 이상의 well에서 CPE가 나타나는 가장 높게 희석된 농도(50% tissue culture infectious dose [TCID₅₀])로 정하였으며 이 희석농도의 역 로가리즘(inverse logarithm)으로 표시하였다.

통계처리
   실험결과는 Kruskal-Wallis test를 이용하여 유의성을 검증하였고, 두 그룹간 비교에는 Mann-Whitney U test를 이용하였다. 통계프로그램은 SPSS 12.0을 사용하였고 p값이 0.05 미만인 경우를 유의한 것으로 정하였다.

결     과

ICAM-1의 발현
   ICAM-1에 대한 평균 형광강도는 RV에 감염되지 않은 대조군과 RV 감염만 시킨 HRV군에서 각각 5.36, 9.18로 나타났다. 이들 값 중 대조군과 HRV군 사이의 형광강도에는 유의한 차이가 있었으며(p<0.05), 농도별로 측정한 SEA군과 HRV+SEA군 사이, SEB군과 HRV+SEB군 사이에도 유의한 차이가 있었다(p<0.05)(Fig. 1). 대조군과 대조군에 포도구균장독소를 농도별로 처리한 SEA군 및 SEB군 사이에는 유의한 차이가 없었고(p>0.05), HRV군과 HRV군에 포도구균장독소를 농도별로 처리한 HRV+SEA군 및 HRV+SEB군 사이에도 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 이 결과는 A549 세포에서 RV 감염이 ICAM-1 발현을 증가시키지만 포도구균장독소가 ICAM-1 발현에 영향을 주지 않았음을 나타낸다.

IL-1β, IL-6, IL-8의 농도
   IL-1β, IL-6, IL-8 평균 농도는 대조군에서 각각 18.2, 160.9, 1989.3 pg/ml이었고, HRV군에서 각각 38.9, 522.8, 3613.1 pg/ml이었다. 대조군과 HRV군 사이의 농도에는 유의한 차이가 있었고(p<0.05), 농도별로 측정한 SEA군과 HRV+SEA군, SEB군과 HRV+SEB군 사이에도 유의한 차이가 있었다(p<0.05)(Figs. 2, 3 and 4). IL-1β, IL-6, IL-8 농도는 대조군과 대조군에 포도구균장독소를 농도별로 처리한 SEA군 및 SEB군 사이에는 유의한 차이가 없었고(p>0.05), HRV군과 HRV군에 포도구균장독소를 농도별로 처리한 HRV+SEA군 및 HRV+SEB군 사이에도 유의한 차이가 없었다(p>0.05). 이 결과는 RV 감염이 IL-1β, IL-6, IL-8 생성을 증가시키지만 포도구균장독소가 IL-1β, IL-6, IL-8 생성에 영향을 주지 않았음을 보여준다.

HRV군과 HRV+SEA, HRV+SEB군에서의 HRV-16 역가
   MRC-5 세포주의 배양을 이용한 바이러스 역가 검사에서 감염군인 HRV군의 역가는 평균 10^2.33 TCID₅₀ U/ml이었다. 감염군에 SEA를 5 ng/ml, 50 ng/ml, 500 ng/ml 처리한 HRV+SEA군에서는 각각 10^2.50, 10^3.17, 10^3.67 TCID₅₀ U/ml이었으며 SEB를 5 ng/ml, 50 ng/ml, 500 ng/ml 처리한 HRV+SEB군에서는 각각 10^2.83, 10^3.17, 10^3.75 TCID₅₀ U/ml이었다. HRV군과 HRV군에 포도구균장독소를 농도별로 처리한 HRV+SEA군 및 HRV+SEB군 사이에 유의한 차이가 있었고(p<0.05), SEA와 SEB의 농도에 비례하여 A549 세포에서 RV 역가가 상승했다(Fig. 5).

고     찰

   대부분의 급성 부비동염은 바이러스성 상기도 감염이 발생한 후 세균 감염이 되어 발생한다고 알려져 있으나^8,9) 만성부비동염 환자에서 RV 감염이 자주 발생하고 증상이 악화되는 원인에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다.
   황색포도구균은 만성 부비동염의 가장 흔한 세균 중 하나이며, 현재까지 초항원으로 작용하는 18개의 장독소(SEA, SEB, SEC1-SEC3, SED, SEE, SEG-SEQ)와 TSST-1을 분비하는 것으로 알려져 있다.⁷⁾ 초항원은 강력한 T세포 유사분열 물질로 항원전달세포(antigen presenting cell)의 항원 처리 과정을 거치지 않고 직접 항원전달세포의 주조직적합복합체(class Ⅱ major histocompatibility complex, MHC)와 결합한 후 T세포 수용체(TcR)의 Vβ부위에도 결합하여 T세포를 활성화시키고 증식을 유도한다.^10,11,12) 일반 항원이 전체 T세포의 0.01%만을 활성화시키는 반면 초항원은 전체 T세포의 30%까지 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 최근의 연구에서 폴립증 환자의 폴립 조직균질액(tissue homogenate) 검사 상 50%에서 SEA, SEB에 대한 특이 항체(specific IgE)가 검출되었으며,¹³⁾ 폴립증을 동반한 만성 부비동염 환자의 55%에서 황색포도구균이 분리되었고, 이들 모두에서 포도구균장독소 A와 B, 독소충격증후군 유발독소-1 등의 초항원이 검출되었다.¹⁴⁾ 만성 부비동염과 병리조직학적으로 유사한 아토피피부염(atopic dermatitis)과 천식의 발병에도 포도구균장독소가 연관되어 있으며,^15,16) SEB에 대한 특이 항체(specific IgE) 역가가 아토피피부염의 질병 정도와 연관되어 있다는 보고가 있다.¹⁷⁾
   이론적으로 포도구균독소의 자극에 의해 분비되는 IL-4, IL-5, IL-13은 폴립증을 동반한 만성 부비동염 환자에서 볼 수 있는 호산구증가증과 림프구(lymphocyte) 침윤을 일으킬 수 있다.¹⁸⁾
   본 연구에서는 실험실적으로 포도구균장독소가 A549 세포에서 RV 감염에 미치는 영향을 연구하였다. 기존의 연구 결과와 같이 ICAM-1의 발현은 RV 감염에 의해 HRV군에서 유의하게 증가하였으나,¹⁹⁾ 농도를 달리하여 포도구균장독소 A와 B를 처리한 SEA군, SEB군, HRV+SEA군, HRV+SEB군 모두에서 농도에 관계 없이 대조군과 HRV군에 비해 ICAM-1의 발현이 증가하지 않았다. Morishita 등의 정상 피부의 장기배양 실험과²⁰⁾ Krakauer 등의 말초혈액 단핵구와 A549 세포를 공동배양(coculture)한 실험에서는²¹⁾ 포도구균장독소 A와 B에 의해 ICAM-1의 발현이 증가되었다. 그러나 본 연구에서는 ICAM-1 발현이 증가하지 않았으며, 이것은 조직에서 포도구균장독소가 항원전달세포와 상호작용하는 것과 달리 본 연구에서는 포도구균장독소가 A549 세포에 단독으로 작용했기 때문인 것으로 생각된다. SEA군과 HRV+SEA군, SEB군과 HRV+SEB군 사이의 ICAM-1의 발현 차이는 RV 감염에 의한 것으로 판단되며 포도구균장독소에 의한 부가적인 영향은 없는 것으로 보인다. 
   본 연구결과 RV 감염에 의해 HRV군에서 염증반응의 매개체인 IL-1β, IL-6, IL-8의 생성이 유의하게 증가하였으나,^19,22) 포도구균장독소 A와 B의 농도에 관계 없이 대조군과 HRV군에 비해 SEA군, SEB군, HRV+SEA군, HRV+SEB군에서 IL-1β, IL-6, IL-8의 생성이 증가하지 않았다. Krakauer 등의 말초혈액 단핵구와 A549 세포를 공동배양(coculture)한 연구에서는 포도구균장독소 A와 B에 의해 IL-1β, IL-6의 생성이 증가되었다.²¹⁾ 그러나 본 연구에서는 IL-1β, IL-6, IL-8의 생성이 증가하지 않았으며, 이것은 항원전달세포와의 상호작용 없이 포도구균장독소가 단독으로 A549 세포에 영향을 주지 못하는 것을 보여준다. SEA군과 HRV+SEA군, SEB군과 HRV+SEB군 사이의 IL-1β, IL-6, IL-8의 생성 차이는 RV 감염에 의한 것으로 판단되며 포도구균장독소에 의한 부가적인 영향은 없는 것으로 보인다. 
본 연구에서 얻은 중요한 결과는 HRV군에 비해 포도구균장독소 A와 B를 처리한 HRV+SEA군, HRV+SEB군에서 RV의 역가가 유의하게 증가되었다는 것이다. 포도구균장독소 A와 B의 농도에 비례하여 RV의 역가가 상승하였고, 500 ng/ml에서는 5 ng/ml, 50 ng/ml에서 보다 역가가 유의하게 높게 나왔다. 이것은 감염된 세포군에서 포도구균장독소에 의해 바이러스 복제가 증가함을 나타낸다. 비강분비물에서 배출되는 바이러스의 양은 증상의 정도와 비례한다고 알려져 있다.²³⁾ 본 연구에서와 같이 포도구균장독소에 의한 바이러스 증가가 만성 부비동염 환자에서 나타나면 그에 따른 증상의 악화도 가능하다는 것을 의미한다.
   ICAM-1은 상피세포에서 RV의 주된 수용체이며, IL-1β는 중요한 proinflammatory cytokine으로 ICAM-1 생성을 증가시켜 RV 감염을 증가시키는 것으로 알려져 있다.¹⁹⁾ 그러나 본 연구에서는 이러한 ICAM-1 발현과 IL-1β의 생성이 증가하지 않으면서 A549 세포에서 RV 복제가 증가하였다. 이 결과에서 RV가 ICAM-1과 결합한 이후의 복제 과정에 포도구균장독소가 영향을 주는 것으로 추정된다.

결     론

   A549 세포에 투여된 포도구균장독소 A와 B가 ICAM-1의 발현과 IL-1β, IL-6, IL-8의 생성을 증가시키지 않았으나 HRV군에서 RV 역가의 상승을 가져왔다. 이것은 포도구균장독소가 RV에 감염된 A549 세포에서 바이러스 복제를 증가시킴을 나타낸다. 즉, 만성 부비동염 환자에서 포도구균장독소에 의한 RV 증가를 초래하여 증상의 악화를 가져오는 것으로 생각된다.

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