교신저자：여상원, 137-040 서울 서초구 반포동 505번지  가톨릭대학교 의과대학 이비인후과학교실
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서     론

   신경접착분자(neural cell adhesion molecule, NCAM) 는 세포 표면에 위치하는 당단백질(glycoprotein)로서 태아 발생과 여러 종류의 세포간 접착성 상호 작용을 나타내며 신경계에서는 신경의 fasciculation, 근신경 상호작용(neuromuscular interaction)과 세포 이동 등에 관한 작용을 한다. Polysialic acid(PSA)는 n-acetylneuraminic acid(Neu5Ac)의 α2,8-ketosidic linkage에 의해 연결된 linear homopolymer의 당질(carbohydrate, sugar chain) 로서 주로 NCAM에 부착되어 NCAM의 기능을 조절한다. PSA가 가지는 음전하(negative charge)로 인하여 NCAM의 접착 기능이 방해되어 세포의 이동성이 증가하게 된다. 이러한 세포 표면에서의 PSA의 발현은 중추신경계와 말초신경계에서는 발생학적으로 조절되어 나타나며 이를 통해서 신경세포의 성장과 이동, fasciculation, 시냅스 형성, 수초화(myelination) 등에 관여하게 되는 것으로 알려져 있다.^1,2,3,4)
   본 실험에서는 기니아 피그의 와우신경절을 분리하고, 신경성장인자인 glial cell derived neurotrophic factor(GDNF), brain derived neurotrophic factor(BDNF)와 neurotrophin 3(NT-3)가 포함된 배양배지에서 이로부터 신경원세포(neuron)와 신경교세포(Schwann cell)로의 분화를 유도하고, 이들 세포에서의 NCAM과 PSA의 발현을 확인하고자 하였다.

재료 및 방법

기니아 피그 와우신경절에서의 와우 신경원세포와 신경교세포의 배양
   실험 동물은 300 g 정도의 생후 6개월 된 기니아 피그를 사용하였다. Pentobarbital을 복강 내에 충분히 주입하여 마취를 유도하고, 이후 기니아 피그의 경부 절제를 시행하여 와우를 채취한 후 현미경하에서 modiolus 내의 와우신경절을 micro-dissector를 이용하여 얻는다. 얻어진 와우신경절 조직은 Ducobecco's modified Eagle's media (DMEM, Gibco, Sweden)가 들어있는 용기에 옮긴 후 3차례 DMEM으로 세척을 시행하였다. 그 후 세척된 와우신경절은 0.25% trypsin이 들어있는 15 ml tube로 옮긴 후 37℃하에서 20분간 배양한다. 그 다음 DNase 10 mg/ml (Sigma, Sweden)를 첨가하고 세포들을 조심스럽게 파쇄하며, 비교적 큰 세포 혹은 조직들은 아래로 가라앉을 수 있도록 2분 정도 실온에 방치한다. 상층액은 새로운 tube로 옮긴 후 10% fetal calf serum(Gibco, Sweden)으로 효소작용을 멈추게 하고, 이들은 다시 1,000 rpm으로 5분간 원심분리를 시행한다. 침전물은 B27 supplement(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), L-glutamin과 gentamycin이 포함된 neurobasal medium으로 다시 용해시킨다. 배양 초기의 배양 배지에는 glial cell derived neurotrophic factor(GDNF, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), brain derived neurotrophic factor(BDNF, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)와 neurotrophin 3(NT-3, Sigma, Sweden)를 첨가하며 이들 세포들은 poly-DL-ornithine(Sigma, Sweden)으로 코팅된 배양 접시에 분양한다. 매 3일마다 배양액의 반 정도를 새로운 배양액으로 바꾸어주며 이때에도 각각의 신경성장인자를 넣어준다. 배양 배지 내의 신경원세포와 신경교세포를 매일 현미경하에서 확인하며, 디지털 카메라를 이용하여 촬영하고 이들의 성장 속도를 Axon Analyzer System^®을 이용하여 확인한다.

면역세포 염색
   각각의 세포들은 S-100(diluted 1：200, Sigma, Sweden), Thy1.1(CD 90, diluted 1：200, Chemicon, Temecula, CA, USA), β-III tubulin(β-tubulin, diluted 1：300, BioSite Taby, Sweden), neural cell adhesion molecule(NCAM, diluted 1：100, Sigma, Sweden) 그리고 polyclonal anti-polysialic acid antibody(diluted 1：100, given by FA Troy)를 이용하여 염색한다. 배양 1주 후 세포들을 phosphate buffered saline(PBS)으로 희석한 4% paraformaldehyde로 10분간 고정 작업을 시행하며 PBS로 세척한다. 신경원세포와 신경교세포의 염색을 위해 1차 항체는 PBS로 희석한 1% bovine serum albumin(BSA)으로 희석하여 사용하고, 1차 항체를 투여한 후 실온에서 1시간 동안 방치하며, 이후 PBS로 희석한 1% saponin으로 5분씩 3차례 세척한다. 이차항체는 실온에서 30분간 투여하며 이후 avidin horseradish peroxidase(Vectastatin ABC(r) kit)로 발현시킨 후 현미경을 이용하여 관찰한다.

결     과

   배양 7일째 coated medium에서 염색을 하지 않은 상태의 세포들은 크게 3가지 부류로 관찰되었다. 첫 번째는 큰 핵을 가지고 있으며 1개 혹은 2개 이상의 줄기(processes)를 내는 세포가 관찰되었는데 이것은 신경원세포(neuron)이었고, 이들 신경원세포들은 축삭(axon) 끝 부분의 growth cone 부위에서는 많은 잔가지를 내면서 자라는 양상을 보였다. 두 번째는 핵은 작으면서 방추 모양(spindle shape)을 가지는 세포들과 세 번째는 배양 배지 내의 대다수를 차지하는 평편한(flat shape) 모양의 세포로서 중간 정도의 핵 크기를 가지는 세포가 관찰되었다(Fig. 1). 이들 세포들은 신경교세포(glial cell, Schwann cell) 들이었으며 신경교세포에 대한 신경원세포의 상대적 분포는 5~10%를 차지하였다.
   신경원세포의 표지자인 β-III tubulin 양성인 세포들은 상대적으로 큰 모양의 핵과 세포체를 가지고 있었고 전술한 바와 같이 1개 또는 2개 이상의 다양한 수의 줄기를 내면서 존재하였으며, 주위의 신경교세포들은 β-III tubulin에 염색되지 않았다(Fig. 2).
   신경교세포의 표지자인 S-100에 양성인 세포들은 2가지 모양의 세포들이 존재하였는데, 그 중 하나는 신경원세포의 핵보다는 작은 핵과 세포체를 가지면서 방추 형태의(spindle shape) 세포 모양을 하고 있었다. 또 다른 하나는 이보다는 다양한 크기의 핵과 세포체(cell body)를 가지면서 편평한 모양을 하고 있었으며 이들은 배양 배지내의 대부분을 차지하고 있었다.
   신경원세포의 성장과 분화는 배양 초기부터 매일 관찰하면서 사진 촬영을 하였고, 이후 Axon Analyzer System^®을 이용하여 신경원세포의 축삭(axon)의 성장속도를 측정한 결과 10~30 μm/h 정도로 자라고 있었으며, 일부에서는 최대 6,000 μm까지 자라는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
   이들 배양 배지에서 자라는 세포들이 섬유모세포의 오염 확인을 위해 섬유모세포의 표지자인 Thy1.1(CD 90)에 대한 염색을 하였으나 이들에 양성을 보이는 세포는 보이지 않았다(Fig. 4).
   NCAM에 대한 염색에서 신경원세포는 모든 세포에서 발현되었고 신경의 세포체뿐만이 아니라 축삭과 growth cone 전반에 걸쳐 발현되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5A). 그리고 신경교세포에서는 방추 모양의 신경교세포와 편평한 모양의 신경교세포에서 신경접착분자가 50% 정도의 비율로 발현됨을 확인할 수 있었으나 발현의 정도는 신경원세포보다는 약하게 나타났다(Fig. 5B and C). 그리고 일부 방추 모양의 신경교세포의 경우 신경원세포와 연접되어 있는 경우 신경접착분자의 발현이 연접하고 있지 않은 것보다는 강하게 발현되었고 신경원세포의 줄기에서도 신경접착분자의 발현을 보이고 있었다(Fig. 5D).
   Polysiaslic acid(PSA)에 대한 검사상 신경원세포의 세포체 부위에서 발현되는 것이 관찰되었다. 신경원세포들 사이에서도 축삭을 내지 않고 있던 세포에서 보다 강하게 발현되었고, 축삭의 성장이 많은 신경일수록 약한 반응을 보였다(Fig. 6A and B). 신경교세포에서는 PSA의 발현을 확인할 수 없었다(Fig. 6C).

고     찰

   세포 표면의 당단백질은 세포의 구조와 기능 유지에 있어 매우 중요한 역할을 하고 있다. PSA는 사람의 신장과 뇌에서 발견되는 oncodevelopmental antigen으로서 일부 종양(Wilm's tumor, neuroblastoma 등)에서 원격전이를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 또한 세포의 성장과 분화, 수정(fertilization), 신경의 병인(neuronal pathogenecity)등에 관련되어 있다. PSA는 n acetylneuraminic acid (Neu5Ac)의 α2,8-ketosidic linkage에 의해 연결된 linear homopolymer의 당질이다. 한편 NCAM은 세포접착분자의 일종으로 세포 표면의 고분자 당단백질로서 세포의 접착과 이동에 관여하며, 일부 종양에서는 신경전이가 있는 종양에서 그 발현이 증가되어 있어 종양의 전이와 관계가 있다고 알려져 있다.^1,2,3,4) PSA 가 포유류의 세포 표면에 발현 시 이는 주로 신경접착분자에 부착되어 발현되며 일부에서는 voltage dependent sodium channel의 α-subunit에서 발현된다.⁵⁾ 이렇게 NCAM에 PSA가 결합되는 경우 PSA가 가지는 음전하로 인하여 NCAM의 세포 간의 접착 능력이 감소하게 된다. NCAM에서 PSA의 발현은 발생과정에서 조절되는데, 태아형 신경접착분자(embryonic form NCAM, polysialylated NCAM, PSA-NCAM)는 많은 수의 sialic acid를 포함하고 있으며(55개 이상, degree of polysialylation>55), 출생 후 NCAM은 sialic acid가 감소되는 과정을 겪게 되어 매우 낮은 수준을 유지하게 된다(adult form NCAM, non-polysialylated NCAM, NCAM). NCAM의 이러한 발생학적 PSA 감소는 정상적인 발생 과정에서 세포 상호 간의 접착과 관련된 기능을 증가시킨다. 따라서 NCAM의 PSA moiety는 살아있는 세포 간의 접착과 상호작용을 조절하는 역할을 하며 이들의 양의 변화는 정상적인 발달과정에서 매우 중요하다.^5,6)
   신경계의 발달에 있어서 NCAM과 PSA 발현은 축삭의 pathfinding, synaptogenesis, 신경세포의 이동과 분화와 관련되어 있음이 알려져 있다.^1,2) 또한 손상된 축삭의 재생과 수초화(remyelination)에도 관련되어 있다고 알려졌는데, 중추 신경계의 신경교세포(glial cell) 중의 하나이며 수초화와 관련된 기능을 지닌 oligodendrocyte에 대한 연구에서는 축삭에서의 PSA의 발현이 수초화의 negative regulator로 알려져 있으며, PSA 소실 시 수초화가 촉진되는 것으로 알려졌다. 그리고 다발성 경화증과 같은 병적인 상태의 탈수초화된 축삭(naked axon)에서는 PSA가 다시 발현되었다고 보고되었다.^7,8,9) 본 실험에서 PSA는 신경원세포의 세포체에서 주로 발현이 되었고 축삭에서는 발현되지 않았다. 그리고 발현의 정도는 축삭을 내고 있지 않은 신경원세포에서 현저하게 발현이 증가되어 있었다. 이는 아마도 PSA가 신경원세포의 분화와 성장과정에서 축삭의 재생 내지는 형성과 관련되어 있으며 따라서 축삭의 형성이 진행됨에 따라 PSA의 발현이 감소되었던 것으로 생각된다. 그리고 신경원세포의 축삭에서 PSA의 미발현과 NCAM의 발현은 축삭들 간의 fasciculation 과정과 세포체의 군집을 이루는 것과 같은 신경절 형성에서 중요한 역할을 하리라 생각된다. 한편 중추 신경계 신경교세포의 다른 한 종류이며 수초화 보다는 중추신경계 내에서 신경에 대한 대사와 기계적 보조 역할(mechanical and metabolic support)의 기능을 가진 astrocyte에서 PSA-NCAM은 분화가 진행되면서 glia fibrillary acidic protein(GFAP)이 발현되는 시기에는 NCAM으로 변하게 된다. 중추신경계 신경교세포의 발달과정에서 S-100과 GFAP가 같은 시기에 발현되므로 S-100에 양성인 신경교세포에서는 PSA가 발현되지 않는다고 하며, 신경교세포에서 NCAM의 발현은 수초화 과정에 관여하는 신경교세포에서 발현된다고 알려져 있다.^{10,11,12,13,14)} 따라서 본 실험에서도 S-100에 양성을 보인 신경교세포들은 PSA을 발현하지 않았던 것은 이러한 발달 단계에 따른 것으로 생각된다. 그리고 Fig. 5D에서와 같이 신경원세포와 연접되어 있는 방추형의 신경교세포에서 NCAM 발현이 강하게 나타남을 알 수 있었는데, 이는 수초화와 관련하여 신경원세포와 신경교세포 간의 접착성 관계를 말해주는 것으로 생각된다. 하지만 발달 단계에서와 병적 상태에서의 수초화와 관련하여 수초화와 관계된 Ran 2 등과 같은 다른 표지자 등을 이용한 연구가 더 필요할 것으로 생각된다.^15,16) 또한 발생의 단계와 시기에 따른 이들의 발현과 이들 세포들의 변화를 실시간으로 관찰한다면 NCAM과 PSA의 발현이 신경계의 발달과 성장, 분화에 대한 역할을 알 수 있으리라 생각된다.
   따라서 본 실험을 통하여 와우신경절에서 분화된 신경원세포와 신경교세포에서의 NCAM의 발현은 신경세포 간의 접착과 fasciculation, 수초화와 신경절의 형성에 중요한 역할을 하리라 생각된다. 그리고 PSA의 미발현은 신경 발달 단계에 따른 현상으로 생각된다. PSA는 fasciculation과 수초화, 신경절의 형성 과정에서 NCAM의 negative regulator로 작용할 것으로 여겨지며 이를 통해서 NCAM의 발달 단계에 맞는 기능을 하게 하는 것으로 생각된다.

결     론

   배양된 와우신경절의 신경원세포와 신경교세포의 일부에서 NCAM이 발현되었고, 특히 신경원세포의 축삭과 신경원세포와 연접한 방추형의 신경교세포에서 강한 발현을 보였다. 그리고 PSA의 경우 축삭을 내지 않고 있는 신경원세포의 세포체에서 강한 발현을 보였으며, 신경교세포에서는 발현을 보이지 않았다.

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