교신저자：동헌종, 135-710 서울 강남구 일원동 50번지  성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 이비인후과학교실
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서     론

   후각은 주위 환경의 변화나 위협을 인식하게 하는 중요한 감각으로 후각장애가 발생한 경우 개인의 삶의 질이 떨어지고 주위 환경에 적절히 대응하지 못해 생명을 위협할 정도의 큰 문제가 생길 수도 있다. 또한 경제가 발달하고 의료보험이 확산되면서 과거에는 심각한 질병으로 받아들이지 않던 후각장애로 인하여 병원을 방문하는 환자수가 증가하고 있으며 Alzheimer's disease같은 병에서는 초기 증상으로 후각장애가 나타날 수 있기 때문에 후각장애에 관한 관심이 높아지고 있다.¹⁾
   하지만 후각장애에 대한 정확하고 객관적인 진단방법이 미흡하고, 이에 대한 치료도 아직까지는 한계가 있다. 이와 같은 배경에서 후각장애의 치료에도 전신적 스테로이드가 경험적으로 사용되고 있으며,^2,3) 이러한 스테로이드는 비강 내 수용체의 해로운 자극에 대한 감수성을 떨어뜨리고 염증반응과 부종을 줄이며 분비선의 콜린성 수용체의 반응성을 감소시키는 것으로 알려져 있지만⁴⁾ 후각기관에 직접적으로 미치는 영향은 그다지 알려져 있지 않다.
   본 연구에서는 스테로이드제를 투여한 실험군과 투여하지 않은 대조군에서 후각상피를 파괴하는 후각독소(olfactotoxicant)인 3-methylindole(3-MI)을 복강 내에 주입하여 후각점막을 파괴한 후에 후각점막의 파괴 및 회복양상을 Hematoxylin-Eosin(H & E) 염색과 면역조직학적 염색으로 관찰하여 전신적으로 투여한 스테로이드가 후각상피세포의 재생에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

재료 및 방법

   실험동물로는 몸무게 100~150 gm의 외견상 건강하고 비공이 깨끗한 암컷 Sprague-Dawley 쥐를 이용하였으며, 23.5±2℃ 온도와 50±5% 습도가 유지되고 12시간 간격으로 광원이 바뀌는 환경에서 사육되었다.
   암컷 24마리를 실험군과 대조군으로 각각 12마리씩 구분하였으며 실험군과 대조군 모두 150 mg/kg의 3-MI를 복강 내 주입하여 후각상피를 파괴시킨 후, 실험군은 3-MI를 주입하기 일주일 전부터 주입 4주일 후까지 격일로 오전 10시에 0.75 mg/kg의 dexamethasone을 25G 바늘과 Mantoux 주사기를 사용하여 마취 없이 복강 내 주입하였고 대조군은 동량의 생리식염수를 같은 방법으로 복강 내 주입하였다. 실험군과 대조군 모두 3-MI 주입 1주, 2주, 3주와 4주 후에 각각 3마리씩 희생시켜 조직을 얻었다. 이후 10% EDTA용액을 이용한 탈회를 거쳐 파라핀 고정을 하기 전에 후각점막 조직표본을 일정한 부위에서 얻어서 비교의 객관성을 얻기 위하여 구강 배측(dorsal aspect)의 특징을 보이는 구조물 즉, 제 이 경구개능(second palatal ridge)에서 경구개에 수직으로 잘랐다. 조직을 ethyl alcohol로 순차적으로 탈수시키고 xylene으로 세척한 후 파라핀에 고정하였다.
   H-E 염색은 파라핀 block을 4 μm 두께로 자르고, 통상의 방법으로 hematoxylin 용액에 3~5분간 염색한 뒤 1% 염산 알코올과 암모니아에 순서대로 침적한 후 eosin 용액으로 1~2분간 감별 염색을 하였다. 그 후 알코올로 탈수하고 carbol-xylene과 xylene에 통과시킨 뒤 봉입하였다.
   면역조직학적 염색은 후각점막내의 세포증식을 관찰하기 위하여 세포합성의 표식자로 많이 사용되고 있는 prolifer-ating cell nuclear antigen(PCNA)과 후각수용세포의 분포를 관찰하기 위하여 신경세포에 특이적으로 존재한다고 알려진 protein gene product 9.5(PGP 9.5)에 대한 면역반응을 측정하였다. ABC(Avidin-biotin complex) kit(DAKO, USA)를 이용한 labelled avidin biotin 기법으로 면역염색 하였으며, 0.1% bovine serum albumin(BSA)을 함유한 TBS에 희석한 일차항원으로 4℃에서 하룻밤 동안(15~17시간) 반응시켰다. TBS로 3회 수세한 뒤 0.1% Triton X-100에 10분간 담구었다가 다시 TBS로 3회 수세하였고, 일차항원으로는 1：100으로 희석한 PCNA(monoclonal anti-mouse；DAKO, USA)와 1：30으로 희석한 PGP 9.5(monoclonal anti-mouse；NOVO, USA)를 사용하였다. Biotin 처리된 이차항체(biotinylated secondary anti-body)를 15분 동안 적용한 뒤 TBS로 3회 수세하였고 av-idin-biotin complex에 10분간 반응시킨 뒤 다시 TBS로 3회 수세하였다. 현미경을 보면서 0.05% diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)로 발색시키고 auto-hematox-ylin으로 대조염색(counterstain)을 실시한 후 cover slip을 덮어 영구표본을 작성하였다.
   표본 관찰은 일정한 부위에서 관찰하기 위해 비중격 상부 좌, 우측 각각 일정한 세 부위에서 광학현미경으로 관찰하였다. H-E 염색 표본에서 후각 상피의 전반적인 상태를 평가한 후 후각상피의 손상과 회복정도를 보기 위하여 후각상피의 높이를 비교하였는데 후각상피의 두께가 정상의 1/3 이하에는 grade 1, 1/3에서 2/3까지는 grade 2, 정상에서 2/3 두께까지는 grade 3로 분류하였다(Fig. 1). 또한 다른 지표로 상피세포들의 배열정도인 columnar arrangement를 측정하였는데, 상피세포들이 poorly arranged된 것은 grade 1, partially arranged된 것은 grade 2, well arranged된 것은 grade 3로 분류하여 분석하였다(Fig. 2). PGP 9.5 및 PCNA 면역염색 표본에서는 후각상피 내 면역반응을 관찰하였으며 세포증식의 빈도를 알아보기 위해 각 해당군별로 비중격 상부의 일정한 부위를 양측에서 각각 2군데씩 관찰하여 400배 시야에서 면역반응에 양성을 보이는 세포수를 측정하였다.
   통계분석은 Wilcoxon rank sum test를 이용하였으며, 유의수준은 5%로 결정하였다.

결     과

   3-MI 투여 후 1주, 2주, 3주와 4주째에 희생시켜 관찰한 H-E 염색 조직표본에서 실험군과 대조군 모두 3-MI 주입 후 1주째는 상피조직이 일부를 제외하고는 전부 소실되었고 일부에서 재생이 이루어지는 모양을 보여 주었으며 2주째에는 상피세포들이 점점 자라나온 모습을 보였으며 3주째에는 높이와 columnar arrangement가 거의 정상으로 돌아왔다(Fig. 3).
   다음으로 비중격 상부의 좌, 우 각각 일정한 세 곳에서 후각상피의 두께를 측정하였다. 반정량적인 방법으로 grade를 나누고 각각의 grade에 해당하는 숫자를 계산하였을 때 실험군과 대조군의 평균 그레이드는 1주 후에는 각각 1.41±0.50, 1.33±0.48(p=0.468), 2주 후에는 2.25±0.65, 2.17±0.70(p=0.628), 3주 후에는 2.50±0.50, 2.39±0.69(p=0.648), 4주 후에는 2.67±0.48, 2.67±0.48(p=1.00)으로 두 군 간의 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 4).
   후각상피세포의 columnar arrangement의 평균 그레이드는 실험군과 대조군에서 1주 후에는 실험군과 대조군 각각 1.50±0.61, 1.78±0.80(p=0.150), 2주 후에는 2.53±0.50, 2.72±0.45(p=0.098), 3주 후에는 2.50±0.50, 2.52±0.56(p=0.815), 그리고 4주 후에는 각각 2.94±0.23, 2.89±0.32(p=0.397)로 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 5).
   주로 후각수용세포(olfactory receptor cell)에 염색이 되는 PGP 9.5 면역염색에서는 주사후 시간이 지나면서 점점 염색되는 세포수가 증가하는 경향을 보였다(Fig. 6). 3-MI 투여 1주에는 대조군에서 염색되는 세포의 개수가 41.3±29.4, 실험군에서 43.8±23.4이었으며(p=0.967), 2주에는 대조군과 실험군 각각에서 42.3±15.0, 144.1±52.0(p<0.001), 3주에는 126.0±35.2, 152.9±53.2(p=0.442), 4주에는 110.4±34.1, 160.8±55.3(p=0.014)이었다. 통계학적으로 1주에는 실험군과 대조군 간에 차이가 없었으나 2주 후부터 dexamethasone을 준 그룹에서 의미있게 염색이 더 많이 되었으며 이런 변화는 3주와 4주까지 이어졌다(Fig. 7).
   활발히 증식하는 기저세포(basal cell)에 염색이 되는 PCNA 염색에서는 3-MI 주입 1주 후에 후각상피에서 염색이 많이 되었으며 시간이 지남에 따라 점점 줄어들었다(Fig. 8). 3-MI 투여 1주에는 대조군에서 염색되는 세포의 개수가 51.7±19.6, 실험군에서 52.4±15.2이었으며, 2주에는 대조군과 실험군 각각에서 34.8±7.4, 22.0±8.9, 3주에는 30.6±6.9, 18.6±9.7, 4주에는 22.4±8.9, 16.5±6.7이었다. 통계학적으로 2주와 3주에서 dexamethasone을 안 준 그룹에서 유의하게 염색이 더 많이 되었으나 4주 이후에는 실험군과 대조군 간에 의미있는 차이를 보이지 않았다(Fig. 9).

고     찰

   후각상피는 외계와 직접 접하고 있기 때문에 여러가지 원인에 의해서 손상이 올 수 있으며 지금까지는 경험적으로 스테로이드 제제가 쓰여져 왔다.^2,3) 하지만 스테로이드가 후각기능의 회복에 관여하는 기전 및 효과에 대해서는 아직 명확하게 파악되지 않고 있으며 여러 저자에 의해 다양한 결과가 보고되고 있다.^5,6,7,8,9)
   본 실험에서는 대표적인 후각독성물질로 알려져 있는 3-MI를 쥐에 주입한 후 스테로이드의 후각점막에 대한 효과를 알아보려 하였다. 3-MI는 대표적인 후각독성 물질로서 말이나 쥐에서 nonciliated bronchiolar epithelial(Clara) cell과 비강 내의 후각 상피를 선택적으로 파괴하는 것으로 알려져 있으며 그 정도는 투여량에 비례하는 것으로 알려져 있고 실험동물의 종이나 연령에 따라 약간씩 차이가 있다.^10,11,12,13) 후각점막상피에 대한 독성 효과는 cytochrome P450(CYP)의 isoform을 생활성화(bioactivation)시킴으로써 나타내는 것으로 알려져 있다.^14,15,16) 이번 실험에서는 dexamethasone을 3-MI 투여 일주일 전부터 주입하여 dexamethasone에 의해 영향을 받아 3-MI의 독성을 변화시킬 수 있는 enzyme을 미리 활성화시킨 후 3-MI를 복강 내로 주입하고 스테로이드제재인 dexamethasone을 주입한 군과 그렇지 않은 군에서의 후각 점막의 상피세포 파괴의 정도와 구성세포의 갯수를 H-E 염색과 면역염색인 PGP 9.5와 PCNA를 이용하여 조사하였다.
   3-MI 주입 후의 후각 점막상피의 변화는 Turk 등¹⁷⁾이 보고한 바와 같이 주입 직후에 심한 괴사성 변화가 관찰되었으며 이런 변화는 시간이 지날수록 회복되어 4주 후에는 후각상피 대부분이 정상으로 회복되었다. 후각상피의 height와 columnar arrangement는 실험군과 대조군 간에 차이가 없었으며, PGP9.5 양성인 후각수용세포는 비록 3-MI 주입 3주 후 군에서 유의한 차이가 관찰되지는 않았으나 전체적으로 2주에서 4주까지에 걸쳐 dexamethasone을 준 그룹에서 더 많은 수가 관찰되었다. Neuron-specific marker인 PGP 9.5는 중추신경계나 말초신경계에서 추출되는 물질로서 후각점막에서는 후각수용체뉴런에서 주로 관찰되며,¹⁸⁾ 이번의 연구에서 이러한 PGP 9.5에 양성반응을 보이는 후각신경세포의 증식이 실험군에서 대조군에 비해 우월하다는 것을 보여주었다. PCNA는 DNA 증식에 관여하는 DNA polymerase의 부가 단백질의 역할을 가지고 있으며 세포증식의 표식자로서 사용된다. 이러한 PCNA에 대한 염색은 현재 증식이 일어나고 있는 세포에서만 반응을 일으키게 되고 따라서 현재 증식이 끝난 후각수용체세포에서는 관찰되지 않고 기저세포나 지지세포에서만 양성반응이 일어나게 된다. 본 실험에서 PCNA 양성인 세포는 두 군 모두에서 관찰이 되었으나 dexamethasone 2주 및 3 주 투여군에서 대조군에 비해 적게 염색되었으며, H & E 염색상 후각상피의 모습이 정상화되는 4주 군에서는 두 군의 PCNA 염색양상이 비슷해지는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 실험으로 dexamethasone이 3-MI로 인해 생기는 조직파괴에는 유의한 보호작용을 하지 않지만 조직의 손상 이후의 신경재생작용에 있어서는 후각수용세포의 재생을 촉진하는 작용을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
   이번 실험의 결과는 동일한 조건으로 Dhong과 Doty가⁵⁾ 실험한 psychophysical 방법과 유사한 결과를 보였으며, 실험동물에서 후각상피의 손상 후 dexamethasone을 준 실험군에서 후각기능이 빨리 회복되는 것에 dexamethasone에 의한 후각수용세포의 재생촉진이 한 가지 원인으로 작용할 수 있다는 가능성을 제시해줄 수 있다고 생각된다. 그 이외에도 dexamethasone의 다양한 작용 부위 중에서 뇌 실질 내의 olfactory nucleus를 포함한 후각과 관련되어 있는 부위에 대한 작용도 후각능력에 영향을 미칠 수 있을 것이다.

결     론

   3-MI로 유발된 후각점막의 손상에 있어서 dexamethasone은 H-E 염색에서 보이는 초기 점막손상에 영향을 미치지는 않았다. 그렇지만 면역조직염색상에서 투여 후에 점막내 세포인 후각 수용세포가 dexamethasone을 투여한 실험군에서 더 증가한 소견을 보여 dexamethasone이 후각수용세포의 재생을 촉진하는 작용이 있음을 확인할 수 있었다.

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